代謝途徑產(chǎn)物的生成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 和發(fā)明背景
[0002] 本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中，涉及生成代謝途徑產(chǎn)物例如蝦青素的生物技術(shù)方 法。
[0003] 細(xì)菌中的天然蛋白質(zhì)豐度跨5個(gè)數(shù)量級(jí)。蛋白質(zhì)表達(dá)水平的平衡處于天然生物系 統(tǒng)正常運(yùn)行的核心并且往往對(duì)于代謝工程成果至關(guān)重要。雖然對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的操 縱，例如強(qiáng)烈的過表達(dá)和低表達(dá)，廣泛用于闡明生物系統(tǒng)的功能，但是平行微調(diào)許多基因的 水平的能力則是主要突出的挑戰(zhàn)。與天然生物系統(tǒng)相反，選擇在進(jìn)化期間平衡蛋白質(zhì)水平 時(shí)，合成系統(tǒng)的表達(dá)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度不平衡。因此，合成途徑在首次引入時(shí)很少發(fā)揮最佳 作用并且必須微調(diào)酶水平。
[0004] 圖15A基于兩步代謝途徑模型示意性描繪了與酶濃度不平衡相關(guān)的主要挑戰(zhàn)。首 先，酶低表達(dá)可限制途徑流量并因此限制產(chǎn)物合成速率（藍(lán)色區(qū)域）。另一個(gè)極端，過度表 達(dá)可能引起蛋白質(zhì)負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致限制生長的細(xì)胞資源耗盡（紫色區(qū)域）。最后，酶生成和消耗 中間代謝產(chǎn)物之間的不平衡可導(dǎo)致代謝瓶頸和高濃度的潛在毒性途徑中間產(chǎn)物（綠色區(qū) 域）。
[0005] 控制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)豐度的方法包括改變啟動(dòng)子K. Hammer, I. Mi jakovic, P. R. Jensen, Synthetic promoter libraries - tuning of gene expression, Trends inBiotechnology 24, 53-55 (2006)]或核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS) [H. M. Salis, E. A. Mirsky, C. A.Voigt,Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression, Nat Biotechnol 27,946-950(2009) ；H. H. Wang 等，Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution, Nature 460, 894-898(2009)]序列，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性和改變成熟蛋白質(zhì)的降解速率。
[0006] 類胡蘿卜素，例如蝦青素為天然色素，是造成活體中所見黃色、橙色和紅色的原 因。類胡蘿卜素在自然界中廣泛分布并且在不同生命系統(tǒng)中，具有兩種主要生物功能：它們 在光合作用中用作捕光色素，并且它們防御光氧化損傷。
[0007] 蝦青素是最昂貴的商業(yè)用類胡蘿卜素化合物（現(xiàn)今的市場(chǎng)價(jià)值高于3, 500$/kg)。 其主要在各種水生動(dòng)物中用作提供色素沉著的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。在遠(yuǎn)東，還用于飼養(yǎng)家禽以引 起雞的典型色素沉著。對(duì)于食品行業(yè)也是可取且有效的無毒色素并且在化妝品中有價(jià)值。 最近，報(bào)道稱蝦青素是人類中的有效抗氧化劑并且因此是可取的食品添加劑。
[0008] 雖然蝦青素在各種細(xì)菌、真菌和藻類中合成，但是對(duì)生物系統(tǒng)用于其生成的關(guān)鍵 限制是其產(chǎn)量低。低產(chǎn)量的其中一個(gè)原因是蝦青素途徑復(fù)雜，由此為了有效表達(dá)，必須在細(xì) 胞中表達(dá)所述途徑的7個(gè)基因。微調(diào)這些基因中每一個(gè)的表達(dá)量對(duì)于優(yōu)化蝦青素表達(dá)是不 可缺少的。
[0009] Lemuth 等，[Microbial Cell Factories 10, 29, 2011]教導(dǎo)了奸青素在大腸桿菌 (E. coli)中的表達(dá)。
[0010] Salis 等，Nature Biotechnology，2009 年第 27 卷 No. 10,第 946-950 頁，教導(dǎo)了 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列。
[0011] 美國專利申請(qǐng)No. 20120015849教導(dǎo)了創(chuàng)建包括人工啟動(dòng)子庫和/或經(jīng)修飾核糖 體結(jié)合位點(diǎn)庫的DNA文庫和用所述文庫轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主細(xì)胞以獲得對(duì)于目標(biāo)染色體基因而 言有一系列表達(dá)水平的一群細(xì)菌克隆的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了多種編碼蝦青素途徑的酶的分離多聚 核苷酸序列，其包含：
[0013] (i)編碼八氫番茄紅素脫氫酶（crtl)的多聚核苷酸和第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0014] (ii)編碼0-番茄紅素環(huán)化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0015] (iii)編碼0-胡蘿卜素酮化酶（crtW)的多聚核苷酸和第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；并且
[0016] 其中選擇所述第一、第二和第三調(diào)控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表達(dá)高 于所述crtl的表達(dá)水平。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了包含多于2mg/g細(xì)胞干重的蝦青素的 細(xì)菌細(xì)胞。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了包含多于5mg/g細(xì)胞干重的蝦青素的 細(xì)菌細(xì)胞。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種生成蝦青素的方法，包括表達(dá)編 碼蝦青素途徑的酶的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
[0020] (i)編碼八氫番茄紅素脫氫酶（crtl)的多聚核苷酸和第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0021] (ii)編碼0 -番茄紅素環(huán)化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0022] (iii)編碼0 -胡蘿卜素酮化酶（crtW)的多聚核苷酸和第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；并且
[0023] 其中選擇所述第一、第二和第三調(diào)控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表達(dá)高 于所述crtl的表達(dá)水平。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種生成蝦青素的方法，包括表達(dá)編 碼蝦青素途徑的酶的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
[0025] (i)編碼異戊烯焦磷酸（idi)的多聚核苷酸和第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0026] (ii)編碼牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶（crtE)的多聚核苷酸和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控 序列；
[0027] (iii)編碼前八氫番茄紅素焦磷酸合成酶（crtB)的多聚核苷酸和第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控 序列；
[0028] (iv)編碼八氫番茄紅素脫氫酶（crtl)的多聚核苷酸和第四轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0029] (V)編碼0-番茄紅素環(huán)化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第五轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0030] (Vi)編碼0-胡蘿卜素酮化酶（crtw)的多聚核苷酸和第六轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；和
[0031] (vii)編碼P_胡蘿卜素羥化酶（crtZ)的多聚核苷酸和第七轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，
[0032] 其中選擇所述第四、第五和第六調(diào)控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表達(dá)高 于所述crtl的表達(dá)水平。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了多種編碼蝦青素途徑的酶的分離多聚 核苷酸序列，其包含：
[0034] (i)編碼異戊烯焦磷酸（idi)的多聚核苷酸和第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0035] (ii)編碼牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶（crtE)的多聚核苷酸和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控 序列；
[0036] (iii)編碼前八氫番茄紅素焦磷酸合成酶（crtB)的多聚核苷酸和第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控 序列；
[0037] (iv)編碼八氫番茄紅素脫氫酶（crtl)的多聚核苷酸和第四轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0038] (V)編碼0 -番茄紅素環(huán)化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第五轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；
[0039] (vi)編碼0 -胡蘿卜素酮化酶（crtW)的多聚核苷酸和第六轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；和
[0040] (Vii)編碼0 -胡蘿卜素羥化酶（crtz)的多聚核苷酸和第七轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，
[0041] 其中選擇所述第四、第五和第六調(diào)控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表達(dá)高 于所述crtl的表達(dá)水平。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述多種分離多聚核苷酸序列進(jìn)一步包含以下至少 一種：
[0043] (iv)編碼異戊烯焦磷酸（idi)的多聚核苷酸和第四轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；或
[0044] (v)編碼牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶（crtE)的多聚核苷酸和第五轉(zhuǎn)錄調(diào)控 序列；或
[0045] (vi)編碼前八氫番茄紅素焦磷酸合成酶（crtB)的多聚核苷酸和第六轉(zhuǎn)錄調(diào)控序 列；或
[0046] (vii)編碼0 -胡蘿卜素羥化酶（crtZ)的多聚核苷酸和第七轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述第一調(diào)控序列、所述第二調(diào)控序列和所述第三 調(diào)控序列的每一個(gè)均為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS)。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，第一調(diào)控序列、第二調(diào)控序列和第三調(diào)控序 列的每一個(gè)均為啟動(dòng)子。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，選擇第一調(diào)控序列、第二調(diào)控序列和第三調(diào)控序列， 以致所述lcy-B和所述crtW的表達(dá)比所述crtl的表達(dá)水平高至少10倍。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，選擇（i)的RBS序列，以致使所述crtl的表達(dá)達(dá)到 具有如SEQ ID N0:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0051] 其中選擇（ii)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表達(dá)達(dá)到具有如SEQ ID N0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0052] 其中選擇（iii)的RBS序列，以致使所述crtW的表達(dá)達(dá)到具有如SEQ ID N0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，選擇（iv)的RBS序列，以致使所述crtl的表達(dá)達(dá)到 具有如SEQ ID N0:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0054] 其中選擇（v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表達(dá)達(dá)到具有如SEQIDN0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0055] 其中選擇（vi)的RBS序列，以致使所述crtW的表達(dá)達(dá)到具有如SEQIDN0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，選擇（i)的RBS序列，以致使所述idi的表達(dá)達(dá)到具 有如SEQ ID N0:5中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0057] 其中選擇（ii)的RBS序列，以致使所述crtE的表達(dá)達(dá)到具有如SEQIDN0:5中 所列序列的RBS至少80 %的程度；
[0058] 其中選擇（iii)的RBS序列，以致使所述crtB的表達(dá)達(dá)到具有如SEQIDN0:3中 所列序列的RBS至少80 %的程度；
[0059] 其中選擇（iv)的RBS序列，以致使所述crtl的表達(dá)達(dá)到具有如SEQ ID N0:7中 所列序列的RBS至少80 %的程度；
[0060] 其中選擇（v)的