沙眼衣原體Tarp蛋白B細(xì)胞表位及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)及免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及來自于沙眼衣原 體Tarp蛋白上的一個B細(xì)胞表位及其編碼核酸，及表位在預(yù)防沙眼衣原體感染相關(guān)疾病的 試劑和/藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙眼衣原體（Ct)為性傳播疾?。⊿TDs)的主要病原之一。感染后主要引起男 性尿道炎和女性宮頸炎，據(jù)報道男性尿道炎中有50-60%由Ct感染引起（Tiodorovi.J， Randelovi.G,Koci.Betal，Bacteriologicalfindingintheurethrainmenwith andwithoutnon-gonococcalurethritis，2007,64 (12) :833-6)，并常與其它病原混合感 染，通過性傳播感染女性泌尿生殖道，導(dǎo)致不良妊娠，如流產(chǎn)、死胎等，并與宮頸癌發(fā)生密切 相關(guān)。Ct感染經(jīng)治療后極易復(fù)發(fā)，WHO估計全球約有9千萬名Ct患者，每年用于治療Ct感 染耗資數(shù)十億美兀（WangSA，PappJR，StammWEetal，Evaluationofantimicrobial resistanceandtreatmentfailuresforChlamydiatrachomatis：ameetingreport. JInfectDis. 2005,191(6) :917-23.)。Ct有19個血清型別，其中D-H等血清型主要 引起泌尿生殖道感染，而其中E和D型則是國內(nèi)外報道（參見：DonatiM，DiFrancesco A,D'AntuonoA,etal.Chlamydiatrachomatisserovardistributionandother concurrentsexuallytransmittedinfectionsinheterosexualmenwithurethritis inItaly.EurJClinMicrobiolInfectDis2009；28 :523-526. ；HanY,YinYP1ShiMQ, etal.DifferenceindistributionofChlamydia_trachomatisgenotypesamong differentprovinces：apilotstudyfromfourprovincesinChina.JpnJInfectDis 2013 ;66 (I) :69-71.)中最為常見的型別。
[0003] 近年來，我國由Ct引起的STDs發(fā)病呈持續(xù)上升趨勢，已對人類健康構(gòu)成了極大危 害。對于Ct感染性疾病，迄今尚缺乏有效的防治方法，而尋求有效的、能防治Ct感染性疾 病的疫苗，是各國相關(guān)學(xué)科工作者的重要課題之一。
[0004] 衣原體和許多其他革蘭陰性病原菌一樣，通過III型分泌系統(tǒng)（TypeIII secretionsystem,T3SS)分泌的各種毒力蛋白，即效應(yīng)蛋白是其主要的致病因素（Hueck CJ.TypeIIIproteinsecretionsystemsinbacterialpathogensofanimalsand plants.MicrobiolMolBiolR1998,62:379-433.)。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)衣原體T3SS的效應(yīng) 蛋白之一,Translocatedactin-recruitingphosphoprotein(Tarp),該蛋白在衣原體的 胞外感染形式一原體（elementarybody,EB)粘附宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)EB進(jìn)入細(xì)胞，故認(rèn)為該 蛋白可能作為衣原體的受體參與EB的粘附入侵。免疫電鏡顯示該蛋白定位于EB結(jié)合宿 主細(xì)胞質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)面，表現(xiàn)為去磷酸化形式。研究認(rèn)為，Tarp已預(yù)先存在于EB的III型 分泌系統(tǒng)注射裝置內(nèi)，當(dāng)與宿主細(xì)胞結(jié)合時通過衣原體III型分泌系統(tǒng)易位至宿主黏膜上 皮細(xì)胞膜，以使其能在介導(dǎo)EB內(nèi)吞時早期引起細(xì)胞骨架的改變。國內(nèi)學(xué)者Wang等（Wang J,ChenL,ChenF,etal.AchlamydialtypeIll-secretedeffectorprotein(Tarp) ispredominantlyrecognizedbyantibodiesfromhumansinfectedwithChlamydia trachomatisandinducesprotectiveimmunityagainstuppergenitaltract pathologiesinmice.Vaccine. 2009, 27 (22) :2967-2980.)也證實(shí)HeLa細(xì)胞感染Ct后 13-24小時檢測不到Tarp蛋白，該段時間胞內(nèi)包涵體內(nèi)充滿始體。感染后28小時，Tarp蛋 白重現(xiàn)，因?yàn)榇藭r始體向EB轉(zhuǎn)換，T3SS效應(yīng)蛋白分子表達(dá)旺盛，需進(jìn)入新的子代EB內(nèi)并成 熟釋放，開始新一輪感染。在宿主細(xì)胞內(nèi)Tarp蛋白被宿主細(xì)胞源性酪氨酸激酶激活而磷酸 化，啟動和參與調(diào)節(jié)肌動蛋白募集反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，致宿主細(xì)胞肌動蛋白骨架重排，從而介 導(dǎo)衣原體EB進(jìn)入宿主細(xì)胞。故Tarp蛋白在衣原體感染過程的第一步，粘附入侵時起關(guān)鍵 作用。
[0005] 臨床衣原體生殖道感染患者和沙眼患者的血清標(biāo)本中普遍存在較高水平的抗 Tarp蛋白的抗體，說明在Ct感染過程中該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng) 產(chǎn)生體液免疫；同時將該蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其能刺激小鼠產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體和 細(xì)胞免疫，而且能顯著降低Ct引起小鼠生殖道感染的炎癥程度。故該蛋白可作為預(yù)防和治 療Ct感染的候選疫苗之一。
[0006] 作為疫苗候選革巴蛋白，Tarp蛋白分子質(zhì)量較大（IOOkDa)，表達(dá)制備較困難，因而， 利用Tarp蛋白上的免疫優(yōu)勢表位可在一定程度上解決上述問題，將有可能發(fā)展成為有前 途的疫苗。表位是抗原分子中可與CTUTh和B細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫和 體液免疫，從而產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的一段氨基酸序列。表位疫苗（Epitopevaccine)是新 近發(fā)展起來，具有獨(dú)特設(shè)計思路，以抗原表位為基礎(chǔ)制備的疫苗。由于表位疫苗設(shè)計的獨(dú)特 性，與減毒活疫苗、滅活苗及其他幾種新型的疫苗相比，表位疫苗具有：①安全、無毒、穩(wěn)定， 可以直接刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，其分子結(jié)構(gòu)小而簡單，不會引起自身免疫反應(yīng)或 免疫抑制；②可對抗原表位進(jìn)行精確的定位，并可對T、B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行不同組合，制成 針對多種病原體的疫苗。因而，通過篩選富含多個CTUTh和B細(xì)胞優(yōu)勢表位的氨基酸序列 為抗原，可達(dá)到既能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答又可減少免疫病理反應(yīng)的目的；能夠有效增強(qiáng)表位提呈 的效率；同時可保持B細(xì)胞表位的天然構(gòu)象等，因而表位疫苗有望成為預(yù)防多種病原體感 染的理想疫苗，被認(rèn)為是將來疫苗的發(fā)展方向。
[0007] 因此，Tarp蛋白是研究防治Ct感染的理想靶抗原之一，其中的B細(xì)胞表位，在誘 導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫方面具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供沙眼衣原體Tarp蛋白上一個B細(xì)胞表位，其編碼核酸及其 應(yīng)用。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的B細(xì)胞表位蛋白，所述蛋白的氨基酸序列 為沙眼衣原體Tarp蛋白上第171-186位氨基酸序列。
[0010] 在一個優(yōu)選例中，所述的表位蛋白不包括全長的沙眼衣原體Tarp蛋白（SEQID N0:3)。在另一優(yōu)選例中，所述的表位蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的表位蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0012] 在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的核酸（B細(xì)胞表位核酸），所述核酸編碼所 述的蛋白。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0014] 在本發(fā)明的第三方面，提供所述的蛋白、所述的核酸在制備用于預(yù)防沙眼衣原體 感染或相關(guān)疾病的組合物中的用途。
[0015] 在一個優(yōu)選例中，所述的沙眼衣原體感染相關(guān)疾病包括（但不限于）：尿道炎、宮 頸炎、沙眼等。
[0016] 在本發(fā)明的第四方面，提供一種組合物，其包含有效量的所述的表位蛋白和藥學(xué) 上或免疫學(xué)上可接受的載體或佐劑。
[0017] 在一個優(yōu)選例中，所述的組合物是疫苗。
[0018] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0019] 圖1.各種不同參數(shù)對CtTarp蛋白的預(yù)測結(jié)果
[0020] A.親水性參數(shù)；B.極性參數(shù)；C.柔韌性參數(shù)；D.表面可能性；E.抗原性
[0021] 圖2.CtTarp蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析。
[0022] 圖3.ELISA檢測免疫小鼠血清中表位特異性IgG抗體水平。
[0023] 圖4.ELISA檢測免疫小鼠陰道分泌物中表位特異性SlgA抗體水平。
[0024] 圖5.Ct感染后各組小鼠外陰炎癥情況。
[0025] 圖6.各組小鼠Ct攻擊后生殖道Ct分離培養(yǎng)和IFU計數(shù)情況。
[0026] 圖7.免疫沉淀和Westernblot分析表位免疫血清對CtTarp蛋白天然抗原的識 別。
[0027]CB:考馬斯亮藍(lán)染色；IPandWB:免疫沉淀和Westernblot分析
[0028]1，3:感染Ct的Hela229細(xì)胞裂解物與B細(xì)胞表位肽免疫小鼠血清的共沉淀后的 SDS-PAGE和Westernblot分析；2,4 :感染Ct的Hela229細(xì)胞裂解物與PBS免疫小鼠血清 的共沉淀后的SDS-PAGE和Westernblot分析。
[0029] 圖8.間接免疫突光分析表位免疫血清對CtTarp蛋白天然抗原的識別。
[0030]PI:紅色熒光代表細(xì)胞核；FITC:綠色熒光，實(shí)驗(yàn)組綠色熒光代表Tarp蛋白，陽性 對照組綠色熒光代表沙眼衣原體。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，以沙眼衣原體全長的Tarp蛋白（CtTarp蛋白，更特別 地為E血清型CtTarp蛋白）為基礎(chǔ)，預(yù)測并篩選了T