油體蛋白、人造油體以及穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及油體蛋白、人造油體以及穩(wěn)定油體結(jié)構(gòu)的方法。更具體地，本申請涉及 突變油體蛋白、包含該突變油體蛋白的人造油體以及通過改變油體粒徑和/或設(shè)計油體蛋 白突變來改變油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂類物質(zhì)是植物儲存能量的主要方式，而種子中的脂類物質(zhì)一般以三酰甘油 (TAG)的形式存在。種子中的TAG分子之間不是彼此聚合的，而是分散成許多小的穩(wěn)定的亞 細胞微滴，該微滴被稱為油體。
[0003] 油體有自身的結(jié)構(gòu)和特征，是種子中獨特的一類細胞器。油體內(nèi)部為液態(tài)TAG，夕卜 部是由一層磷脂分子及油體蛋白組成的半單位膜。油體的直徑范圍為〇. 5至2. 0ym，其成 分包括：（1) 92%至98%的中性脂類，其主要為TAG，約占95% ; (2) 1%至4%的磷脂（PL)，其 主要為磷脂酰膽堿，約占PL的60%至70% ;和（3) 1%至4%的油體蛋白（如8〇111'.(：.1'狀11. Integralproteinsinplantoilbodies.ISRNBotany2012:173954)，其中的憐脂分子可 以為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等化合物中的一種或多種，也 可以為包含上述磷脂分子的組合物，如復合磷脂(包括但不限于大豆磷脂)，或卵磷脂。
[0004] 油體蛋白鑲嵌在油體表面，對維持油體的穩(wěn)定極為重要，能夠在空間上阻礙油體 單元之間相互聚合。不同植物來源的油體蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)特性，即都具有3個基本的 結(jié)構(gòu)域。第一個結(jié)構(gòu)域是N端40至60個氨基酸組成的兩親性區(qū)域，其兼具親水性和親脂 性，分布于油體朝向胞漿的一側(cè)。第二個結(jié)構(gòu)域是中間約50個氨基酸組成的高度疏水區(qū) 域。據(jù)推測，該區(qū)域為伸入TAG基質(zhì)中的反式平行的￠-折疊結(jié)構(gòu)，頂部具有由3個脯氨 酸和1個絲氨酸組成的"脯氨酸結(jié)"，該脯氨酸結(jié)的氨基酸結(jié)構(gòu)為PX5SPX3P。這一區(qū)域，尤 其是"脯氨酸結(jié)"，在不同來源的油體蛋白中高度保守，維持其特殊的拓撲結(jié)構(gòu)，對油體蛋白 革巴向形成油體有重要意義（CijsJ.H.vanRooijenandMauriceM.Moloney.Structural RequirementsofOleosinDomainsforSubcellularTargetingtotheOilBodyPlant Physiol. 1995:109,1353-1361)。第三個結(jié)構(gòu)域是C端33至40個氨基酸組成的a-螺旋 結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域兼具親水和親脂性，其帶正電荷的基團朝向PL層帶負電荷的部分，帶負 電荷的部分朝向油體表面（GitteI.Frandsenetal.Oilbodiesandtheirassociated proteins,oleosinandcaleosin.PhysiologiaPlantarum2001:112,301 - 307)。
[0005] 將目前利用細菌表達的油體蛋白或天然的油體蛋白、TAG和磷脂按照比例混合，體 外合成人造油體的技術(shù)已經(jīng)得到了很大的發(fā)展。人造油體表達系統(tǒng)可用于開發(fā)、合成及純 化外源蛋白質(zhì)，如醫(yī)藥、保健、營養(yǎng)所需的蛋白質(zhì)等。將經(jīng)重組的油體蛋白與適當比例的TAG 和磷脂混合，經(jīng)超聲波振動即可形成人造油體。
[0006] 為了最大限度地提高人造油體的利用率，減少蛋白浪費，需要提高油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性。
[0007]JasonT.C(JasonT.C.Tzen.Integralproteinsinplantoilbodies.ISRN Botany2012:173954)中指出，改變油與油體蛋白的比例，能夠改變油體粒徑；越少的油體蛋 白加入，油體的粒徑就越大。但該文章并沒有指出這種相關(guān)性的準確的比例及范圍。蛋白 量加入到一定的時候，再增加蛋白量，反而會使整個體系的穩(wěn)定性發(fā)生變化，尤其粒徑會產(chǎn) 生非線性變化。
[0008]Chi-ChungPengCChi-ChungPengetal,Minimizingthecentralhydrophobic domaininoleosinfortheconstitutionofartificialoilbodies.JAgricFood Chem. 2007:11，：5604-10.)中利用定點突變，通過截斷基因序列來改變油體蛋白的結(jié)構(gòu)，以 求在功能不變的情況下縮短基因序列。但是，突變后的花生油體蛋白并沒有出現(xiàn)優(yōu)于未突 變的蛋白的性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本領(lǐng)域亟需一種能夠提高油體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的方法，從而提高人造油體的利用率， 減少蛋白浪費。
[0010] 在第一方面，提供了一種突變油體蛋白，其脯氨酸結(jié)的第7位點的絲氨酸（S)替換 為脯氨酸(P)。
[0011] 在第二方面，提供了一種人造油體，其包含第一方面的突變油體蛋白。
[0012] 在第三方面，提供了一種控制人造油體的粒徑的方法，包括將油體蛋白、油脂以 及磷脂混合，優(yōu)選地，所述油體蛋白占混合物的總摩爾比2%-58%，2. 5%-50%，3%-13%或 4. 53-12. 41%,
[0013] 可選擇地，油脂占混合物的總摩爾比22%-97. 9%，37. 7-95%，86-92%，或 87. 27-91. 01% ；
[0014] 可選擇地，磷脂占混合物的總摩爾比為0. 1%-20%，或0. 1%-12. 3%，0. 2%-1%，或 0. 31-0. 32% ；
[0015] 優(yōu)選的，所述油體蛋白、油脂、磷脂的摩爾比例為：（2-58) : (22-97. 9) : (0. 1-20)， 優(yōu)選為（2. 5-50) : (37. 7-95) : (0? 1-12. 3)，優(yōu)選為（3-13) : (86-92) : (0? 2-1)，更優(yōu)選為（4. 53-12. 41) : (87. 27-91. 01) : (0. 31-0. 32) 〇
[0016] 在第四方面，提供了一種提高人造油體的穩(wěn)定性的方法，包括將第一方面的突變 花生油體蛋白與油脂和任選的磷脂混合。
[0017] 本公開通過在體外構(gòu)建人造油體，得到了人造油體結(jié)構(gòu)粒徑變化的線性范圍，使 人造油體結(jié)構(gòu)在一個可控范圍內(nèi)，從而起到穩(wěn)定人造油體結(jié)構(gòu)的作用。
[0018] 本公開還將油體蛋白進行了定向突變，將脯氨酸結(jié)上的絲氨酸突變?yōu)楦彼?，?此將人造油體結(jié)構(gòu)維持更持久，從而能夠提高油體蛋白的性能，減少蛋白的浪費。
[0019] 在第五方面，提供了一種人造油體，其粒徑范圍為4.41ilm至1.85ilm。在一些實 施方案中所述人造油體通過本申請第三方面或第四方面所述的方法控制油體粒徑和/或 提高油體穩(wěn)定性而制備的。
【附圖說明】
[0020] 圖1示出不同油體蛋白的電泳圖，其中，泳道1 :芝麻油體蛋白0.ImMIPTG誘導3h 上清；泳道2 :芝麻油體蛋白0.ImMIPTG誘導3h沉淀；泳道3 :花生油體蛋白0. 5mMIPTG 誘導3h上清；泳道4 :花生油體蛋白0.5mMIPTG誘導3h沉淀；泳道5:大豆油體蛋白0.ImM IPTG20度過夜誘導上清；泳道6:大豆油體蛋白0.ImMIPTG20°C過夜誘導沉淀；泳道7 :棕 櫚油體蛋白〇.5mMIPTG誘導3h上清；泳道8 :棕櫚油體蛋白0. 5mMIPTG誘導3h沉淀；泳 道9:0. 5mMIPTG誘導空質(zhì)粒PET28a;M為分子量標記。箭頭指向目的蛋白條帶。
[0021] 圖2示出大腸桿菌表達出來的160iig和320iig芝麻、花生和大豆油體蛋白與 200yg的磷脂以及15mg的五類油脂混合得到的人造油體直徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有花生油與花 生油體形成的人造油體，對蛋白量的變化最敏感：蛋白量增加一倍，油體粒徑減小了一半左 右。
[0022] 圖3示出人造油體的粒徑測試結(jié)果。在花生油體蛋白添加量在80iig到240iig 的范圍內(nèi)，隨著蛋白量的增加，粒徑呈線性縮小，蛋白添加量320yg時，人造油體的粒徑略 有增加，但在蛋白添加量為480iig時，人造油體的粒徑進一步縮小。
[0023] 圖4示出花生油體蛋白添加量與人造油體的粒徑的線性關(guān)系。
[0024] 圖5示出花生油體蛋白添加量在80iig到240iig(4%到12%的摩爾百分比)的范 圍內(nèi)與人造油體的粒徑的線性關(guān)系。
[0025] 圖6出人造油體的穩(wěn)定性測試結(jié)果。在蛋白添加量在80iig、120iig、160iig、 200iig和240iig(4%到12%的摩爾百分比）的范圍內(nèi)，隨著蛋白量的增加，其結(jié)構(gòu)乳化特 性更好。
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