一種高效價(jià)豬藍(lán)耳病卵黃抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗體制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高效價(jià)豬藍(lán)耳病卵黃抗體的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬藍(lán)耳?。╬orcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是我國(guó)豬 病中最主要的一種免疫抑制病，主要引起大量懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)下死胎等，給養(yǎng)豬業(yè) 帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。像其他傳染病一樣，豬藍(lán)耳病的主要預(yù)防手段是接種疫苗，但是在實(shí) 踐過(guò)程中，藍(lán)耳病疫苗防治經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)免疫失敗，其主要原因是疫苗免疫時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生中和 抗體時(shí)間較長(zhǎng)，或不能產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，如高致性藍(lán)耳病滅活苗需要14天才能產(chǎn)生，20 天才能達(dá)到有效保護(hù)，而在此期間均有可能感染。因此，采用人工主動(dòng)與被動(dòng)聯(lián)合免疫防治 豬藍(lán)耳病具有重要意義。
[0003] 針對(duì)目前畜禽重大疾病尤其是病毒性疾病的防治中無(wú)特效藥物，利用卵黃抗體 (EggYolkImmunoglobulin，IgY)對(duì)畜禽進(jìn)行被動(dòng)免疫來(lái)防治畜禽傳染病是一種很好的措 施。卵黃抗體是通過(guò)對(duì)禽類(lèi)（雞）免疫注射特定抗原，從卵黃中獲得特異性多克隆抗體的 技術(shù)。IgY通過(guò)被動(dòng)免疫方式使用，在畜禽和水產(chǎn)業(yè)的重大傳染病的防控和治療中發(fā)揮了巨 大作用。
[0004] 獲得高效價(jià)的卵黃抗體的關(guān)鍵是用抗原刺激使得機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的、穩(wěn)定的抗體。 免疫佐劑的應(yīng)用是提高疫苗免疫效果的重要途徑之一，可增強(qiáng)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和反應(yīng)的持 久性。中藥成分佐劑在提高疫苗免疫效果方面已經(jīng)有很多研究，已有多種中藥多糖具有很 好的免疫增強(qiáng)效果，中藥提高卵黃抗體效價(jià)的報(bào)道也有很多，如魯敏等證實(shí)蜂膠佐劑滅活 苗能夠促進(jìn)抗CPV的特異性卵黃抗體的產(chǎn)生，并能夠達(dá)到較高的抗體效價(jià)水平。鑒于豬藍(lán) 耳病防治過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)疫苗免疫失敗及制備高免卵黃抗體的需要，亟須一種制備高效價(jià) 的卵黃抗體的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種高效價(jià)豬藍(lán)耳病 卵黃抗體的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種高效價(jià)豬藍(lán)耳病卵黃抗體的制備方 法，具體包括以下步驟：
[0007] 1)取20?30周齡的健康蛋雞，詞喂一周后，進(jìn)彳了首次免疫，在首次免疫后14天、 28天分別進(jìn)行二次免疫和三次免疫，所述的首次免疫、二次免疫和三次免疫的處理方法相 同，所述的免疫的方法為：肌肉分點(diǎn)免疫豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)活疫苗0.2ml/羽，同 時(shí)通過(guò)飲水給藥喂食桑葉杜仲提取物5mg/羽；收集免疫后2?6周內(nèi)所產(chǎn)的免疫PRRS疫 苗的雞蛋；
[0008] 2)將步驟1)收集的免疫PRRS疫苗的雞蛋，經(jīng)75%酒精消毒后，用卵黃分離器分 離蛋白，收集卵黃，棄卵黃膜，加相當(dāng)于卵黃液9倍體積的酸化水（pH5. 2)稀釋，充分?jǐn)嚢瑁?4°C冰箱中靜置超過(guò)6h，10000r/min4°C離心lOmin，收集上清液獲得卵黃水提液（Water SolubleFraction,WSF)；
[0009] 3)采用凍融法純化卵黃抗體IgY:置卵黃水提液于_70°C冰箱中過(guò)夜，取出，解凍 后10000r/min離心15min，棄去沉淀，收集上液，經(jīng)0. 22iim濾膜過(guò)濾后，獲得純化后的豬藍(lán) 耳病卵黃抗體IgY。
[0010] 步驟1)中所述的蛋雞優(yōu)選為羅曼蛋雞或白羽蛋雞。
[0011] 步驟1)中所述的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗優(yōu)選為豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 (R98 株）。
[0012] 步驟1)中桑葉杜仲提取物5mg/羽中的濃度以中藥多糖計(jì)。
[0013] 步驟1)中所述的桑葉杜仲提取物由桑葉多糖和杜仲提取物制成，每1000ml桑葉 杜仲提取物由桑葉280-320g和杜仲皮50-100g制成。
[0014] 步驟2)中所述的酸化水是在1000ml生理鹽水中加入0.lmol/1的冰醋酸，調(diào)節(jié)PH 值為5.2。
[0015] 上述方法獲得的抗體效價(jià)測(cè)定方法，具體步驟如下：用T6病毒滴度的繁殖與呼吸 綜合征病毒（PRRSV)包被96孔板，每孔100iU，4°C孵育過(guò)夜；棄去板中包被液，用洗滌液 洗3次，每次lmin，加1 %BSA200ill封閉，37°C作用2h，棄去板中溶液，洗滌液洗3次，每 次3min;在每孔中加入IOOiU已稀釋不同濃度梯度待測(cè)陽(yáng)性卵黃提取液，設(shè)陰性對(duì)照、PBS 對(duì)照，37°C作用lh，棄去板中溶液，用洗滌液洗3次，每次3min;加入1:5000稀釋度羊抗雞 HRP-IgG二抗，每孔100iil，37°C作用Ih;棄去板中溶液，洗滌液洗3次，每次5min;加底物 顯色液，每孔100UL，37°C避光作用15min;2mol/lH2S0jS止顯色，每孔50ill;測(cè)定各孔的 OD4Jt;判定指標(biāo)：陽(yáng)性O(shè)D值> 1. 0,陰性O(shè)D值< 0. 3,當(dāng)（0D_ -ODpbs)A〇D_ -ODpbs) > 2. 1，即表示該稀釋倍數(shù)的卵黃抗體效價(jià)，取最高卵黃提取液稀釋度對(duì)數(shù)為幾何平均效價(jià) 滴度。
[0016] 所述的已稀釋不同濃度梯度待測(cè)陽(yáng)性卵黃提取液為上述獲得的純化后的豬藍(lán)耳 病卵黃抗體IgY從1:8開(kāi)始2倍倍比稀釋，稀釋至2'優(yōu)選為豬藍(lán)耳病卵黃抗體的稀釋度 為2'所述的陰性對(duì)照為未經(jīng)PRRSV免疫的空白對(duì)照組卵黃提取液。
[0017] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0018] 本發(fā)明中高效價(jià)豬藍(lán)耳病卵黃抗體的制備方法，通過(guò)采用目前已有的免疫豬繁殖 與呼吸綜合征（PRRS)活疫苗免疫蛋雞，在免疫過(guò)程中通過(guò)喂食桑葉杜仲提取物，增加疫苗 的的免疫效果、增強(qiáng)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和反應(yīng)的持久性；通過(guò)收集2?6周的免疫PRRS疫苗 的雞蛋，提取卵黃水提液，對(duì)卵黃水提液采用凍融法純化獲得卵黃抗體IgY，獲得豬藍(lán)耳病 卵黃抗體的效價(jià)高，制備方法簡(jiǎn)單且易大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明制備方法中的桑葉杜仲提取物 通過(guò)喂食的方法能夠明顯提高機(jī)體免疫功能，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，以及桑葉杜仲提取物的中藥 成分符合當(dāng)前綠色食品的需求，本研究選擇桑葉杜仲提取物作為免疫增強(qiáng)劑以制備高效價(jià) 藍(lán)耳病卵黃抗體，對(duì)豬藍(lán)耳病的緊急治療具有實(shí)用價(jià)值，從而對(duì)減少養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，促 進(jìn)新型獸用生物藥物開(kāi)發(fā)等具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為實(shí)施例1中IgY水提物及純化后SDS-PAGE圖，其中：M.標(biāo)記蛋白；1.卵黃 水提液；2.純化后IgY;3.牛血清白蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 1.試驗(yàn)一 ：30周齡健康羅曼蛋雞16只，購(gòu)自泰州某養(yǎng)殖場(chǎng)，飼喂自配無(wú)抗蛋雞全 價(jià)料1周。隨機(jī)分為4組，每組4只，分別于首免及首免后14天、28天肌肉分點(diǎn)免疫豬繁殖 與呼吸綜合征活疫苗（R98株）0? 2ml/羽（一組）、0? 4ml/羽（二組）、0? 6ml/羽（三組）、 0.8ml/羽（四組）。不添加使用任何疫苗佐劑。分別于免疫后第1周、2周、3周、4周、5周、 6周、7周、8周、9周收集各組雞蛋，用于卵黃抗體效價(jià)測(cè)定，以確定最佳疫苗免疫劑量。
[0023] 2.試驗(yàn)二：20周齡健康白羽蛋雞30只（由泰州某養(yǎng)殖場(chǎng)提供），飼喂自配無(wú)抗蛋 雞全價(jià)料。一周后，隨機(jī)分為3組，每組10只。分別為桑葉杜仲提取物組、免疫對(duì)照組（VC) 和空白對(duì)照組（BC)。除空白對(duì)照組注射0. 2ml生理鹽水外，其余各組分別胸肌分三點(diǎn)注射 0. 2ml/羽PRRS疫苗。同時(shí)，桑葉杜仲提取物組按照5mg/羽（以中藥多糖計(jì)）分別飲水給 藥，首免后間隔兩周進(jìn)行二免和三免，按相同的方式給藥。免疫前1周和免疫后連續(xù)9周， 每組隨機(jī)抽取4只雞蛋，采用ELISA法測(cè)定卵黃中PRRSV特異性IgY抗體效價(jià)。
[0024] 3?試驗(yàn)三：卵黃抗體水提液的制備
[0025] 收集免疫PRRS疫苗雞的蛋，經(jīng)75%酒精消毒后，用卵黃分離器分離蛋白，收集 卵黃，棄卵黃膜，加相當(dāng)于卵黃液9倍體積的酸化水（pH5. 2)稀釋，充分?jǐn)嚢瑁?°C冰箱中 靜置超過(guò)6h，10000r/min4°C離心lOmin，收集上清液獲得卵黃水提液（WaterSoluble Fraction,WSF)〇
[0026] 4?試驗(yàn)四：卵黃抗體的純化
[0027] 采用凍融法純化IgY。置WSF于_70°C冰箱中過(guò)夜，取出，解凍后lOOOOr/min離心 15min,棄去沉淀,收集上液,經(jīng)0. 22iim濾膜過(guò)濾后，即為純化后的IgY。
[0028] 5.試驗(yàn)五：特異性IgY抗體ELISA方法的建立
[0029] (1)抗原最佳包被濃度的確定