靶向t淋巴細胞的人源單鏈抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質工程技術領域，具體地說，涉及編碼包含人源⑶3 抗體可變區(qū)片段的DNA、其所編碼的重組蛋白、該重組蛋白的生產方法、該重組蛋白的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003]T淋巴細胞是一種在人體內廣泛分布的免疫效應細胞，在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作 用。T淋巴細胞發(fā)揮抗腫瘤效應的前提是其細胞內活化、增殖信號的啟動。研宄表明，CD3 分子（clusterofdifferentiation3)是T淋巴細胞活化的關鍵分子，其細胞內的免疫受 體酪氨酸活化基序（ITAM)可以提供T淋巴細胞活化所需的下游信號。目前，針對CD3分子 的單克隆抗體可以有效誘導CD3細胞內的ITAM磷酸化，從而激活T淋巴細胞。因此，CD3抗 體可以被用作一種提高腫瘤免疫的藥物。比如，商品化的CD3抗體0KT-3,當采用低劑量時 已經被用于激活T淋巴細胞，可以提高腫瘤免疫。
[0004] 當前，單克隆抗體已經成為一類重要的生物技術藥物，主要以gamma球蛋白為主， 即IgG型抗體。IgG型抗體由2條重鏈和2條輕鏈通過二硫鍵構成，分子量約150kD。作為 人體治療用的單克隆抗體主要為IgG型嵌合抗體和采用CDR移植技術構建而成的人源化抗 體。在這些抗體中，原來鼠源的抗體恒定區(qū)被替換為人源抗體恒定區(qū)，甚至鼠源抗體可變區(qū) 中框架區(qū)的部分氨基酸也被替換為人源抗體基因的氨基酸。通過這些改造，在一定程度上 減少了原來鼠源抗體療法引起的HAMA(Humanantimousantibody)效應，提高了臨床治療 效果。盡管如此，由于抗體可變區(qū)的部分氨基酸仍然為鼠源序列，因此無法完全避免HAM 效應的發(fā)生。
[0005] 從抗體藥物應用來說，人源抗體是用于人體治療最理想的抗體，可以有效減少 抗-抗體的產生，這可以避免提高抗體藥物的耐藥。但是由于技術上的難度，目前世界上成 功的人源抗體極少。首先，由于倫理限制，無法采用類似制備小鼠雜交瘤細胞的方法借助人 體生產人源抗體。其次，目前世界上轉人源抗體基因的工程小鼠極少，更為關鍵的是由于抗 體多樣性產生的過程需要重鏈V-D-J基因重排和輕鏈V-J基因重排，而人抗體基因重排過 程在小鼠體內受到很大限制，因此導致抗體的多樣性受限。另外，抗體庫技術近年來也被用 于篩選人源抗體，但是由于缺乏類似人體內生發(fā)中心中的抗體親和力成熟過程，因此產生 的抗體親和力常常較低。然而，由于人源抗體獨特的優(yōu)勢和巨大的治療價值，目前已經成為 抗體藥物發(fā)展的重要方向。已經上市的阿達木單抗（adalimumab)就是通過抗體庫技術產 生的人源單克隆抗體，用于治療自身免疫性疾病，已經獲得了巨大成功。
[0006]近年來，基因工程抗體發(fā)展迅速，其中單鏈抗體（single-chainvariable fragment，scFv)就是一種重組小分子抗體。單鏈抗體由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過一 條柔性連接肽構成，其大小僅為完整IgG型抗體的1/6,因而具有較好的組織滲透性。由于 體積較小，單鏈抗體也經常與其他效應分子融合，作為重組蛋白藥物的靶向識別域，因此單 鏈抗體具有十分廣闊的應用前景。盡管如此，由于缺乏抗體恒定區(qū)的支撐，因此并非所有單 鏈抗體都能夠保留有效的抗體結合活性，需要進行檢驗證實。而且，多數(shù)單鏈抗體的結合活 性不足，往往需要進一步優(yōu)化，因此獲得具有足夠結合活性的單鏈抗體是比較有挑戰(zhàn)性的 工作。
[0007] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種CD3單鏈抗體，特別的是，其重鏈和輕鏈可變區(qū)來源于 人類抗體胚系基因，因此組成此CD3單鏈抗體的氨基酸為人源抗體序列。本發(fā)明的CD3人 源單鏈抗體能夠結合并靶向CD3陽性的T淋巴細胞。更重要的是，此抗體為全人源序列，可 以有效地避免臨床治療應用中的HAM發(fā)生。為本領域的具體提供了一種新的有效選擇，具 有很好的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種抗人CD3的人源單鏈抗體，其能夠結合 ⑶3陽性的T淋巴細胞。
[0009] 本發(fā)明首先提供了一種抗人CD3的抗體輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO. 4所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種抗人⑶3的抗體重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO. 2 所示。
[0011] 上述的兩段序列均為本發(fā)明首次獲得的人源化序列。
[0012] 在獲得了上述人源化序列的基礎上，本發(fā)明提供了一種抗人CD3的單鏈抗體，該 單鏈抗體是是由上述的抗人CD3的抗體輕鏈可變區(qū)和抗人CD3的抗體重鏈可變區(qū)連接而 成。
[0013] 輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的排列方式為VH-VL或VL-VH，VH位于單鏈抗體的N端， VL位于單鏈抗體的C端，表示為CD3ScFv-VHVL。VL位于單鏈抗體的N端，VH位于單鏈抗體 的C端，表示為CD3ScFv-VLVH，
[0014] 其中，上述抗人CD3的單鏈抗體中，所述的抗人CD3的抗體輕鏈可變區(qū)和抗人CD3 的抗體重鏈可變區(qū)之間通過連接肽進行連接。連接肽可用本領域常用的各種連接肽。
[0015] 其中，上述抗人⑶3的單鏈抗體中，其結構可選的為輕鏈可變區(qū)-重鏈可變區(qū)、重 鏈可變區(qū)-輕鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)-連接肽-重鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)-連接肽-輕鏈 可變區(qū)中的任意一種。
[0016] 其中，在上述抗人CD3的單鏈抗體中，所述的連接肽的氨基酸序列為 GGGGSGGGGSGGGGS或VEGGSGGSGGSGGSGGVD。
[0017] 優(yōu)選的，上述抗人⑶3的單鏈抗體的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 6或SEQ IDNO. 8 所述。
[0018] 本發(fā)明還提供了編碼上述抗人CD3的抗體輕鏈可變區(qū)的基因。本發(fā)明提供了編碼 上述述抗人CD3的抗體重鏈可變區(qū)的基因。本發(fā)明還提供了編碼上述的的抗人CD3的單鏈 抗體的基因。
[0019] 其中，上述的編碼抗人CD3的抗體輕鏈可變區(qū)的基因，其核苷酸序列如序列表中 的SEQIDNO. 3或其簡并序列所示。
[0020] 上述的編碼抗人⑶3的抗體重鏈可變區(qū)的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO. 1或其簡并序列所示。
[0021] 其中，上述的編碼抗人CD3的單鏈抗體的基因，其核苷酸序列如序列表中的SEQID NO. 5或7所示，或為它們的簡并序列所示。
[0022] 在上述方案的基礎上，本發(fā)明還提供了上述編碼基因的重組載體。這些種族載體 可以選自質?；虿《尽?br>[0023] 本發(fā)明也進一步地提供了包含上述重組載體的宿主細胞。所述宿主細胞可是真核 細胞或原核細胞。
[0024] 本發(fā)明還提供了上述的抗人CD3的單鏈抗體在制備T淋巴細胞結合劑中的應用。
[0025] 本發(fā)明的有益效果在于：提供了一組抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列，由該重鏈可 變區(qū)和輕鏈可變區(qū)重組而成的單鏈抗體具有結合CD3的生物學活性，從而能夠靶向CD3陽 性的T淋巴細胞。
【附圖說明】
[0026] 圖1?本發(fā)明⑶3單鏈抗體的人類胚系基因（germlinegene)來源。
[0027] 圖2.本發(fā)明⑶3單鏈抗體的蛋白空間結構示意圖。
[0028] 圖3.本發(fā)明⑶3單鏈抗體重組載體示意圖。
[0029] 圖4本發(fā)明⑶3單鏈抗體的表達鑒定和純化分析。左：免疫印跡檢測細胞培養(yǎng)上 清中CD3單鏈抗體的表達。右：細胞培養(yǎng)上清通過鎳柱親和純化，凝膠電泳顯示高純度的 ⑶3單鏈抗體。
[0030] 圖5.流式細胞術分析本發(fā)明CD3單鏈抗體的靶向結合活性。上：陰影峰為陰性對 照，中間線形峰為⑶3單鏈抗體，最右側線形峰為商品化⑶3抗體。下：陰影峰為陰性對照， 線形峰為CD3單鏈抗體。
[0031] 圖6.ELISA分析本發(fā)明⑶3單鏈抗體的靶向結合活性。<