一種畢赤酵母菌Pichia sp.SIT2014及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酵母菌及其用途，更具體的說(shuō)是涉及一種畢赤酵母菌5/7. SIT2014及其培養(yǎng)方法和利用其作為生物催化劑制備手性芳基鄰二醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性化合物在人類生活中有著重要的作用，由于同一種化合物的兩種對(duì)映體在藥 理、毒理以及功能作用上面都存在巨大的差異，因此制備光學(xué)純的手性模塊化合物在醫(yī)藥、 農(nóng)藥、環(huán)保、材料等領(lǐng)域都具有重要的意義。
[0003] 而光學(xué)純的手性芳基鄰二醇，如（S)-苯乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的手 性添加劑，也是合成許多光學(xué)活性藥物以及一些功能材料的重要中間體。手性芳基鄰二醇 一般有兩種合成的方法。
[0004] 一種為外消旋體二醇的動(dòng)力學(xué)拆分合成方法。該方法存在的一個(gè)不足在于它的理 論產(chǎn)率只有50%。
[0005] 第二種方法為前體酮的不對(duì)稱還原合成方法。相比于第一種方法，該方法的 理論產(chǎn)率可以達(dá)到100%的光學(xué)純的手性二醇的化合物。目前，有很多方法可以應(yīng)用到 手性二醇的制備上，主要集中于化學(xué)法和生物法，Hatakeyama等（Hatakeyama, Taito etal. Process for producing optically active alcohols. U. S. Pat. AppI. Publ., 20110282077，17 Nov 2011)利用化學(xué)催化劑釕復(fù)合物對(duì)前體羥基苯乙酮進(jìn)行還原得到
[5] -苯乙二醇，光學(xué)純度值最高為94. 6%，且反應(yīng)過(guò)程中用到手性催化劑以及有機(jī)溶劑對(duì) 環(huán)境污染造成一定影響。
[0006] 2008年魏東芝等(魏東芝、林金萍、高瓊，一種微生物不對(duì)稱拆分制備S-苯乙二 醇的方法，中國(guó)專利，專利號(hào)ZL200810038899. 0,授權(quán)公告日，2013年1月2日）研究一種 微生物作為催化劑制備S-苯乙二醇，該方法雖然得到的手性化合物光學(xué)純度值較高，可達(dá) 99. 9%，制備過(guò)程對(duì)環(huán)境友好，但采用動(dòng)力學(xué)拆分的方法，而動(dòng)力學(xué)拆分的理論產(chǎn)率最高為 50%。實(shí)際轉(zhuǎn)化率只有38%，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，需要33-96h。
[0007] 2009年張榮珍等(張榮珍、徐巖、耿亞維，一種羰基還原酶重組菌高效制備（S)-苯 基乙二醇的方法，中國(guó)專利，專利號(hào)ZL200910263147. 9,授權(quán)公告日，2012年5月23日）利 用羰基還原酶重組菌，可以高產(chǎn)率高選擇性的催化羥基苯乙酮還原為（S)-苯乙二醇。不過(guò) 基因工程菌在傳代過(guò)程中具有潛在的質(zhì)粒丟失風(fēng)險(xiǎn)造成其傳代穩(wěn)定性較差，在培養(yǎng)過(guò)程中 需要加入昂貴的誘導(dǎo)劑異丙基_β-D-硫代半乳糖苷和抗生素，致使發(fā)酵廢液的環(huán)境治理 成本提升，而且未見(jiàn)其應(yīng)用于合成其它結(jié)構(gòu)的手性芳基乙二醇。
[0008] 綜上所述，手性芳基鄰二醇的制備方法或者存在合成步驟復(fù)雜環(huán)境不友好，或者 光學(xué)純度以及產(chǎn)率低，或者菌種穩(wěn)定性差、底物譜狹窄等問(wèn)題而難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此有必 要開發(fā)一種具有較廣底物應(yīng)用范圍的、具有較高活性和選擇性的羰基還原酶生物催化劑來(lái) 克服上述技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的之一在于提供一種畢赤酵母PicAia sp. SIT2014 CGMCC NO. 9300。
[0010] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種上述的畢赤酵母PicAia sp.SIT2014 CGMCC NO. 9300的培養(yǎng)方法。
[0011] 本發(fā)明目的之三在于提供一種將畢赤酵母PicAia sp. SIT2014 CGMCC NO. 9300作 為生物催化劑應(yīng)用的方法，即將畢赤酵母Z7ZcAia sp.SIT2014 CGMCC NO. 9300作為生物催 化劑，催化多種前體2-羥基芳基乙酮不對(duì)稱還原為相應(yīng)的手性芳基鄰二醇，均可獲得99% 以上的轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度。該手性芳基鄰二醇的微生物制備方法中，手性芳基鄰二醇反應(yīng) 時(shí)間短，僅需3-24h，轉(zhuǎn)化率高，最高可達(dá)99. 9%。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案 一種畢赤酵母Pichia sp. SIT2014,是一種屬于真菌類酵母菌屬的菌株，該菌株是從中 國(guó)上海地區(qū)土壤中分離得到的，于2014年06月16日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9300,保藏機(jī)構(gòu)地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1。
[0013] 上述的畢赤酵母sp.SIT2014 CGMCC NO. 9300菌株具有如下微生物學(xué)特 征： (1) 、形態(tài)特征 畢赤酵母菌株細(xì)胞呈球形，橢圓型，偶爾呈錐形，但不形成尖頂。菌落表面光滑、濕潤(rùn)、 粘稠，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落為乳白色； (2) 、培養(yǎng)學(xué)特征 在酵母粉-胰蛋白胨-葡萄糖瓊脂上菌落不透明，有光澤，呈現(xiàn)乳白色； (3) 、生理生化特征 兼性厭氧性菌； (4) 、運(yùn)動(dòng)性：不運(yùn)動(dòng) (5) 、碳源同化 陽(yáng)性：D-半乳糖、L-三梨糖、D-木糖、蔗糖、麥芽糖、甲基a-D-批喃葡糖苷、纖維二糖、 水楊苷、甘油、乙醇； 陰性：D-葡萄胺、蜜二糖、乳糖、棉子糖、淀粉、半乳糖醇、肌醇、D-葡萄糖酸、D-葡糖醛 酸、甲醇； (6) 、生長(zhǎng)最適宜溫度：25°C -32°C。
[0014] 該菌種經(jīng)傳代20次后，依然保持性狀穩(wěn)定，因此具有良好的傳代穩(wěn)定性。
[0015] 利用上述畢赤酵母/7ZcAia sp. SIT2014作為生物催化劑制備手性芳基鄰二醇，即 將畢赤酵母sp. SIT2014作為生物催化劑催化2-羥基芳基乙酮進(jìn)行不對(duì)稱還原反 應(yīng)得到手性芳基鄰二醇； 所述的2-羥基芳基乙酮為2-羥基苯乙酮、2-羥基間氯苯乙酮、2-羥基鄰氯苯乙酮、 2_羥基對(duì)溴苯乙酮或2-羥基對(duì)氯苯乙酮； 對(duì)應(yīng)所得的手性芳基鄰二醇為（S)-苯乙二醇、（S)-間氯苯乙二醇、（S)-鄰氯苯乙二 醇、（S)-對(duì)溴苯乙二醇或（S)-對(duì)氯苯乙二醇。
[0016] 上述畢赤酵母PicAia sp. SIT2014作為生物催化劑可以高選擇性、高產(chǎn)率以及低 成本的來(lái)催化合成手性芳基鄰二醇。
[0017] 上述的利用上述畢赤酵母/7ZcAia sp. SIT2014作為生物催化劑制備手性芳基鄰二 醇的方法，具體包括如下步驟 (1) 、畢赤酵母PicAia sp. SIT2014的培養(yǎng) 取4°C冰箱保存的畢赤酵母PicAia sp. SIT2014斜面菌種，挑取一環(huán)菌種接入到裝有 15ml種子培養(yǎng)基的IOOml搖瓶中，在搖床上控制溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為180rpm進(jìn)行種子培養(yǎng) 12-18h，得到種子液； 然后按種子液：發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為5%的接種量，將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中， 在搖床上控制溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為180rpm進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)15-24h，得到的發(fā)酵液離心，收獲 細(xì)胞即為畢赤酵母sp. SIT2014細(xì)胞，然后將其置于緩沖液中保存； 以上所述的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基相同，按每升計(jì)算，含葡萄糖15g，胰蛋白胨5g，酵 母粉 5g，K2HPO4 0· 5g，KH2PO4 0· 5g，NaCl lg，MgSO4 · 7H20 0· 5g，余量為水； 所述的緩沖液為pH5. 5-8. 0的磷酸鈉水溶液，優(yōu)選為pH5. 5?7. 0的磷酸鈉水溶液，更 優(yōu)選為pH 6. 5的磷酸鈉水溶液，其用量按畢赤酵母細(xì)胞sp. SIT2014干重：緩沖液 為5-100g:lL的比例計(jì)算； (2) 、向步驟（1)所得的含有畢赤酵母sp. SIT2014細(xì)胞的緩沖液中加入羥基芳 基乙酮，然后控制溫度為30-50°C進(jìn)行還原反應(yīng)3-48h得到反應(yīng)液； 上述反應(yīng)所用羥基芳基乙酮的量，按畢赤酵母細(xì)胞sp. SIT2014干重：羥基芳 基乙酮為5-100g :5-100mmol的比例計(jì)算； (3) 、將步驟（2)的反應(yīng)液控制轉(zhuǎn)速為lOOOOr/min進(jìn)行離心分離，得到的上清液用等體 積的乙酸乙酯萃取三次后，萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，即得手性芳 基鄰二醇。
[0018] 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的一種畢赤酵母PicAia sp. SIT2014 CGMCC NO. 9300,由于其具有易于培養(yǎng)，傳 代穩(wěn)定性高，其菌體內(nèi)羰基還原酶活性較高，對(duì)2-羥基芳基乙酮的還原性與選擇性較強(qiáng)， 其用于生物催化劑催化2-羥基芳基乙酮制備手性芳基鄰二醇，具有轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)時(shí)間短 等特點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)99. 9%，光學(xué)活性值在99%以上，從投入畢赤酵母PicAia sp. SIT2014細(xì)胞直至得到手性芳基鄰二醇，僅需3-48h。并且傳代20次后所得的畢赤酵母 PicAia sp. SIT2014菌落形態(tài)保持不變，發(fā)酵所得細(xì)胞作為生物催化劑催化2-羥基芳基乙 酮制備手性芳基鄰二醇，其轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度依然都可達(dá)99%以上，因此其傳代穩(wěn)定性高。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過(guò)一些實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但并不限制本發(fā)明。
[0020] 本發(fā)明所用的試劑分別是分析純或者HPLC純的試劑。
[0021] 手性芳基鄰二醇光學(xué)純度值的檢測(cè)，采用島津高效液相色譜儀LC-20A，出自于島 津儀器公司； 本發(fā)明各實(shí)施例中目標(biāo)產(chǎn)物的（R，S)-苯乙二醇色譜分析條件如下： 流動(dòng)相為正己烷：異丙醇=95:5,流速0. 8ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為27°C，采 用手性O(shè)D-H柱（4. 6mmX250mm，購(gòu)于大賽璐藥業(yè)手性技術(shù)(上海）有限公司）。
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