產(chǎn)磷脂酶c的地衣芽孢桿菌及其產(chǎn)生的磷脂酶c的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶脫膠領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種產(chǎn)磷脂酶C的地衣芽孢桿菌及其產(chǎn)生的磷 脂酶C。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷脂酶（Phospholipase, PL)是生物體內(nèi)存在的能水解甘油磷脂的酶，水解產(chǎn)物 為各種磷脂酸和氨基醇，如膽胺、膽堿、絲氨酸、乙醇胺等。根據(jù)磷脂酶水解甘油磷脂的位點(diǎn) 不同，可將憐脂酶分為憐脂酶A(Phospholipase A，PLA)、憐脂酶B(Phospholipase B，PLB)、 憐脂酶 C(Phospholipase C，PLC)和憐脂酶 D (Phospholipase D，PLD)，如圖 1 所不。
[0003] 磷脂酶可廣泛應(yīng)用于油脂精練、磷脂改性、飼料改良劑、食品工業(yè)和醫(yī)藥等方面。 脫膠是植物油精煉過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，對(duì)提高油的品質(zhì)至關(guān)重要，脫膠主要是脫除磷 月旨，脫膠若不徹底，會(huì)影響油品的深加工和油品的穩(wěn)定性，減低油品貨架期。酶法脫膠可以 克服傳統(tǒng)脫膠方法脫膠脫除率低，同時(shí)中性油損失高等的問(wèn)題。而在酶法脫膠工藝中，現(xiàn)有 文獻(xiàn)多報(bào)道磷脂酶PLA用于植物油脫膠。磷脂酶PLA (包括PLAl和PLA2)，脫膠后可產(chǎn)生極 性溶血磷脂和極性脂肪酸，PLA脫膠工藝僅僅損失油中總的磷脂分子，來(lái)減少精煉損耗。而 磷脂酶PLC酶通過(guò)選擇性水解磷酸酯官能團(tuán)與磷脂反應(yīng)，生成甘油二酯（DAG)和磷脂酸基 團(tuán)，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脫膠工藝通過(guò)保留原始的磷脂分子而僅去除磷酸酯 官能團(tuán)來(lái)減少精煉損耗，不存在PLA脫膠工藝中產(chǎn)生的能提高脫膠油酸價(jià)的極性脂肪酸的 問(wèn)題，PLC用于脫膠優(yōu)勢(shì)明顯好于PLA。
[0004] 磷脂酶C (PLC)可來(lái)源于動(dòng)物和微生物。文獻(xiàn)報(bào)道磷脂酶C細(xì)菌來(lái)源的有： 粘質(zhì)沙雷氏菌武漢株（Serratia marcescens wuhan strain)、假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridum perfringens)、諾氏梭狀芽孢桿 菌（Closrtidium novyi)、雙酶梭狀芽抱桿菌（clostridium bifermantans)、洋蔥假單 胞菌（Pseudomonas cepacia)、金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus)、錯(cuò)狀芽抱 桿菌（Bacillus cereus)、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)、類鼻疽伯克 氏菌（burkholderia pseudomallei)。憐脂酶C霉菌來(lái)源的有：煙曲霉（Aspergillus fumigates)、黃曲霉（Aspergillus flavus)、自佐氏曲霉菌（Aspergillus saitoi)。憐脂 酶C酵母來(lái)源的有白色念珠菌（canidia Albicans)。JP50-1017183報(bào)道斯谷假單胞菌 (Pseudomonas schuylkilliensis)可以產(chǎn)憐脂酶 C。JP49-55893 報(bào)道來(lái)源于 streptomyces hachi jyoensis 的憐脂酶 C。
[0005] 磷脂酶C的芽孢桿菌來(lái)源相關(guān)報(bào)道中，蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌來(lái)源的 PLC的相關(guān)文獻(xiàn)和專利報(bào)道的比較多，并未有來(lái)源于地衣芽孢桿菌的磷脂酶C的相關(guān)報(bào)道。 US6284517公開(kāi)了蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌有磷脂酶C活性。JP55034039報(bào)道蘇云 金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)可以產(chǎn)磷脂酶C。US3909360報(bào)道錯(cuò)樣芽孢桿菌產(chǎn) 磷脂酶A和磷脂酶C。
[0006] 蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌是引起水源和食物等污染的常見(jiàn)菌，蠟樣芽孢桿 菌可厭氧生長(zhǎng)、有運(yùn)動(dòng)性、該菌呈長(zhǎng)桿狀，寬度大于1微米。而有報(bào)道的真菌煙曲霉和黃曲 霉來(lái)源的磷脂酶C，煙曲霉和黃曲霉也是公認(rèn)的致病菌，無(wú)法在食品工業(yè)中使用。
[0007] 地衣芽孢桿菌自身無(wú)致病性，而且地衣芽孢桿菌是GRAS (Generally Recognized as Safe，GRAS是美FDA評(píng)價(jià)食品添加劑的安全性指標(biāo)）菌株，地衣芽孢桿菌在飼料中的 應(yīng)用，可直接用作畜禽的復(fù)合微生態(tài)制劑（CN201010232600. 2)，也可以用于發(fā)酵秸桿飼 料（CN201010164201. 7)，提高飼料的蛋白量。地衣芽孢桿菌是一些重要工業(yè)酶制劑的生 產(chǎn)菌，地衣芽孢桿菌能夠分泌多種酶，其中能夠應(yīng)用到醫(yī)藥領(lǐng)域的酶主要有絲氨酸纖溶性 蛋白酶(納豆激酶）和脂肪酶兩種。我國(guó)的豆豉纖溶酶和韓國(guó)的大豆發(fā)酵食品中分離的 纖溶酶也都是地衣芽孢桿菌分泌的絲氨酸纖溶性蛋白酶的一種。地衣芽孢桿菌可以發(fā)酵 生產(chǎn)堿性蛋白酶（CN03144206. 4, CN201110220386. 3)，還可以用于提升白酒釀造的風(fēng)味 (CN201110233172. X)等等，所以，地衣芽孢桿菌更安全可靠。
[0008] 但目前尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌產(chǎn)磷脂酶PLC的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種分離的表達(dá)磷脂酶C的菌株。
[0010] 本發(fā)明提供的分離的表達(dá)磷脂酶C的菌株，命名為WBRD01160,保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 7878。
[0011] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種生產(chǎn)磷脂酶C的方法。
[0012] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)磷脂酶C的方法包括：培養(yǎng)前述的菌株以使所述菌株或細(xì)胞生 產(chǎn)磷脂酶C，收獲磷脂酶C。
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)為在適宜所述菌株生長(zhǎng)和/或適宜所述 菌株表達(dá)磷脂酶C的條件下培養(yǎng)所述菌株，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)為在適宜所述菌株生長(zhǎng)的條 件下培養(yǎng)所述菌株，以增加所述菌株數(shù)量，然后再于適宜所述菌株表達(dá)磷脂酶C的條件下 培養(yǎng)所述菌株，以表達(dá)所述磷脂酶C。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述培養(yǎng)為在25-40°C、120-250rpm培養(yǎng)所述菌 株6-24h。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述收獲包括分離和收集含有分泌或釋放到胞外 的磷脂酶C的培養(yǎng)物上清液，由此獲得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；優(yōu)選地，所述方法還 包括對(duì)所述磷脂酶C酶液進(jìn)行濃縮。
[0016] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種磷脂酶C。
[0017] 本發(fā)明提供的磷脂酶C為用前述方法制得。
[0018] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種磷脂酶C酶液。
[0019] 本發(fā)明提供的磷脂酶C酶液為用前述方法制得。
[0020] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種脫膠的方法。
[0021] 本發(fā)明提供的脫膠的方法為使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液進(jìn)行脫膠，優(yōu)選 的，所述脫膠為油脂脫膠。
[0022] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脫膠 的用途，優(yōu)選的，所述脫膠為油脂脫膠。
[0023] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂 改性、食品添加劑、飼料改良劑和醫(yī)藥工業(yè)的用途。
[0024] 本發(fā)明的產(chǎn)磷脂酶C的細(xì)菌-地衣芽孢桿菌（Bacillus Iicheniformis) WBRD01160及使用該菌株獲得的酶液和磷脂酶C可以用于油脂精煉，脫膠效果良好，由于地 衣芽孢桿菌是GRAS菌株，因此，可以直接用于食品工業(yè)，安全可靠，例如可以安全方便的用 于油脂精煉。同樣地衣芽孢桿菌來(lái)源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加劑、飼 料改良劑和醫(yī)藥工業(yè)等方面。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1顯示磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D的酶切作用示意圖。
[0026] 圖2顯示地衣芽孢桿菌WBRDOl 160磷脂酶C水解磷脂酰膽堿的TLC檢測(cè)結(jié)果，其 中泳道1為1，2二油酸甘油酯，泳道2為1，3二油酸甘油酯，泳道3為三油酸甘油酯，泳道 4為枯草芽孢桿菌來(lái)源粗磷脂酶C酶液水解磷脂酰膽堿后的樣品，泳道5為磷脂酰膽堿。
[0027] 圖3顯示地衣芽孢桿菌WBRDO1160磷脂酶C的最適溫度檢測(cè)結(jié)果。
[0028] 圖4顯示地衣芽孢桿菌WBRDO1160磷脂酶C的最適pH檢測(cè)結(jié)果。
[0029] 圖5顯示地衣芽孢桿菌WBRDO1160發(fā)酵濃縮酶液在不同溫度下孵育后酶活檢測(cè)結(jié) 果。
[0030] 圖6為地衣芽孢桿菌WBRDOl 160磷脂酶C的pH穩(wěn)定性曲線。
[0031] 圖7顯示不同金屬離子、檸檬酸和EDTA等對(duì)地衣芽孢桿菌磷脂酶C活性的影響。
[0032] 本發(fā)明的菌株WBRD01160已于2013年7月4日保藏在"中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)"（北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生 物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)是CGMCC No. 7878,分類命名為：地衣芽孢桿菌Bacillus Iicheniformis0
【具體實(shí)施方式】
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