一株香豬源性降膽固醇、耐氧雙歧桿菌bz25的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物，特別涉及降膽固醇、耐氧雙歧桿菌。
【背景技術】
[0002] 膽固醇廣泛存在于動物組織細胞中，是構成細胞的重要成分之一，在人體中發(fā)揮 著重要的生理作用。它在體內轉化形成類固醇激素，是合成維生素 D以及膽汁酸的前體物 質。體內膽固醇主要有兩個來源，一是食物，二是內源合成。有些人由于不合理膳食習慣， 血液膽固醇含量超過正常指標；而體內膽固醇含量過高會造成動脈粥樣硬化、冠心病等心 腦血管疾病，嚴重威脅到人類健康。據(jù)報道，全球心腦血管疾病引起人類死亡的人數(shù)占總死 亡人數(shù)的29%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預測，到2030年，心腦血管疾病仍將是導致人類死亡的 主要原因，而血清中的膽固醇過高是引發(fā)冠心病、動脈硬化、腦中風等心腦血管疾病的重要 因素。有研究發(fā)現(xiàn)與擁有正常血脂的人相比，高膽固醇血癥的人患心臟病的風險是其正常 人的3倍。因此，通過降低血清膽固醇水平來對心腦血管疾病進行防治是一種實效可行的 研究方向，具有潛在的應用價值和廣闊是市場空間。
[0003] 欲降低體內膽固醇，除了通過合理飲食以外，運用生物轉化法，特別是運用益生菌 對膽固醇進行直接降解已成為研究的趨勢。雙歧桿菌作為人體腸道內的一類益生菌，其益 生作用有維持腸道內菌群平衡、降低血清膽固醇、抗腫瘤等益生作用。而貴州香豬是貴州省 特色資源，屬于小型豬，其遺傳穩(wěn)定，器官結構和功能與人體相似。因此，從香豬中篩選出來 的雙歧桿菌易于為人體所接受和利用。
[0004] 目前中國專利數(shù)據(jù)庫中，涉及雙歧桿菌的專利申請件很多，但涉及耐氧雙歧桿菌 的專利申請件僅有浙江大學申請的ZL2009100965117號《一種耐氧性雙歧桿菌》和天津科 技大學申請的ZL2011100894937號《一種耐氧耐酸性長雙歧桿菌》2件。這兩個雙歧桿菌能 否降膽固醇不得而知。迄今為止，尚無涉及降膽固醇、耐氧動物雙歧桿菌的申請件。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一株香豬源性降膽固醇、耐氧雙歧桿菌，使之有可能作為益生菌 進一步深度開發(fā)利用，添加到發(fā)酵乳制品中使其成為功能性食品，以降低人體膽固醇含量， 促進人類健康。
[0006] 發(fā)明人提供的香豬源性降膽固醇、耐氧雙歧桿菌，該菌株為動物雙歧桿菌乳亞種 (Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)，該菌株的純培養(yǎng)物已于 2014 年 12 月 18 日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，該中心地址是：中國北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101 ;保藏編號 為CGMCC NO. 10225,簡稱為動物雙歧桿菌乳亞種BZ25。該菌株是從貴州特色資源小香豬的 腸道內溶物中篩選與分離純化得到。
[0007] 上述動物雙歧桿菌乳亞種BZ25的形態(tài)特征及生理生化特征菌均接近于雙歧桿 菌屬，其16S rRNA基因序列與動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalis subsp. Lactis)的16S rRNA序列同源性在99%以上，根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》中雙歧桿 菌屬的分類規(guī)定，動物雙歧桿菌乳亞種BZ25屬于放線菌門（Actinobacteria)、放線菌綱 (Actinobacteria)、放線菌亞綱（Act inobacteridae)、雙歧桿菌目（Bifidoacteriales)、 雙歧桿菌科（Bif idobacteriaceae)、雙歧桿菌屬（Bif idobacterium)，動物雙歧桿菌乳亞 種（Bifidobacteriumanimalis subsp. Lactis)〇
[0008] 發(fā)明人提供的菌株是從貴州特色資源小香豬腸道內溶物中分離并初步篩選出 具有降膽固醇能力的雙歧桿菌，并對所得的菌株以降膽固醇率、耐酸耐膽鹽受性為指標進 行進一步的復篩，復篩出一株膽固醇去除率高且耐酸受性、耐膽鹽受性均良好的雙歧桿菌 菌株，然后對該菌株進行耐氧性能實驗，最終通過對該菌株進行形態(tài)學、生理生化試驗鑒 定和16S rRNA序列鑒定，最終鑒定出此菌株為動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animal is subsp.Lactis)〇
[0009] 為了驗證本發(fā)明的菌株，發(fā)明人進行了如下實驗：
[0010] ⑴樣品的采集與分離純化
[0011] 從貴州省特色資源小香豬的多個部位采樣，包括小腸、大腸以及新鮮的小香豬糞 便中，編號并記錄，并迅速帶回實驗室處理。取IOg的新鮮樣品放入裝有90mL的無菌生理鹽 水中，人工搖勻后，在潔凈工作臺內用移液槍吸取IOOul混合液涂布于含有Li-Mupirocin 的MRS平板上，置于厭氧培養(yǎng)箱（厭氧環(huán)境為N2: CO2: H2= 90 : 5 : 5)中，37°C培養(yǎng) 48h，然后挑取單菌落接種于含有X-gal的PTYG平板上，放入37°C、20% CO2濃度的二氧化 碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，觀察菌落顏色、形態(tài)并進行革蘭氏染色、鏡檢，記錄菌株形態(tài)特征。將 疑似雙歧桿菌菌株在PTYG平板上純化傳代4次后，甘油保藏于-80°C的超低溫冰柜中。
[0012] 上述MRS瓊脂培養(yǎng)基成分為：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，吐 溫 801mL，K2HP042g，醋酸鈉 5g，檸檬酸二銨 2g，MgSO4 · 7H20 0· 58g，MnSO4 · 4H20 0· 25g，瓊 月旨20g ;制法是將各成分加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，調pH值至6. 5,121 °C滅菌15min，備 用。
[0013] 上述含有Li-Mupirocin的MRS (MUP-MRS)中，IOOmLMRS瓊脂培養(yǎng)基含有5mg的莫 匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin)。
[0014] 上述PTYG液體培養(yǎng)基成分為：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖 l〇g，吐溫801mL，鹽溶液40mL ;制法是將各成分加熱溶解于IOOOmL蒸餾水中，調pH值至 6. 5,121°C滅菌 15min，備用。
[0015] 上述培養(yǎng)基中的鹽溶液成分為：無水CaCl2O. 2g，K2HPO4L Og，KH2PO4L Og，MgSO4 ·7Η 20 0. 48g，Na2CO3IOg, NaCl 2g ;制法是將 CaClJP MgS04 · 7Η20 混合在 300mL 蒸餾水中直至 溶解，加入500mL水，攪拌同時緩慢加入其他鹽類，直至溶解；再加入200mL蒸餾水，混合后 貯存于4°C，備用。
[0016] 上述PTYG瓊脂培養(yǎng)基制法為：在每IOOOmL的液體培養(yǎng)基中加入20g瓊脂粉，加熱 煮沸，121°C滅菌15min后傾注平板，備用。
[0017] 上述含有X-gal的PTYG (PTYG-X)培養(yǎng)基制法為：在每IOOOmL的改良PTYG培養(yǎng)基 中加入X-gal 40mg，由于X-gal不耐高溫，直接用無菌水稀釋濃度為20mg/mL，每個PTYG平 板涂布40 μ L,備用。
[0018] (2)膽固醇去除率的測定
[0019] 將初篩所得的菌株采用鄰苯二甲醛法（OPA)測其膽固醇去除率。
[0020] (3)待測菌懸液的制備
[0021] 將保藏在_80°C的超低溫冰柜中的菌株活化，劃線純化3次后，接種于PTYG液體培 養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，然后將菌懸液離心，收集菌泥，將菌液濃度調至10 8CFU/mL，菌懸浮液 帶用于體外耐受實驗。
[0022] (4)酸耐受性實驗
[0023] 將待測菌懸液按5 % (體積比）接種量分別接種于pH3. 0和pH7. 0的滅菌PTYG液 體培養(yǎng)基中，混勻后37°C下靜置2h，進行平板計數(shù)。
[0024] (5)膽鹽耐受性實驗
[0025] 將待測菌懸液按5% (體積比）接種量分別接種于添加0· 3% (質量/體積）牛 膽鹽的滅菌PTYG液體培養(yǎng)基和不含牛膽鹽的滅菌PTYG液體培養(yǎng)中，37°C恒溫二氧化碳培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于Oh和24h進行活菌計數(shù)。
[0026] (6)耐氧性能實驗
[0027] 將經過耐酸性和膽鹽耐受性的菌株接種到PTYG培養(yǎng)基中分別在普通培養(yǎng)箱和 20% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，進行平板計數(shù)。對兩者生長去進行對比以判斷 其耐氧性。
[0028] 通過上述采樣、分離純化的初篩實驗以及以菌株的降膽固醇率，耐受性為指標進 行復篩，最終得到一株菌株BZ25,其降膽固醇率高，達到36. 32 %，且耐酸受性和耐膽鹽受 性好，并對氧有較好耐受性。
[0029] (7)菌株的鑒定
[0030] 對所得菌株進行生理生化鑒定以及種屬的鑒定，了解其生理生化特征，對有效地 應用文獻、指導進一步研究和應用有重要作用。因此，對本發(fā)明中的菌株BZ25進行了生理 生化實驗鑒定以及16S rRNA序列的鑒定。
[0031] 形態(tài)特征：將菌株接種于PTYG平板上，37°C培養(yǎng)48h，其菌落形態(tài)為菌落較小、光 滑、凸圓、邊緣整齊、白色或乳白色不透明且質地柔軟，在PTYG-X平板上則呈現(xiàn)出深藍色的 菌落。挑取其菌落進行革蘭氏染色，其革蘭氏染色呈陽性，且在光學顯微鏡下觀察其細胞形 態(tài)呈多形態(tài)桿狀，符合雙歧桿菌細胞形態(tài)特征。其生理生化實驗結果見表1。
[0032] 表1細胞形態(tài)及理化試驗結果
[0033]
【主權項】
1. 一株香豬源性降膽固醇、耐氧雙歧桿菌BZ25,其特征在于該菌株為動物雙歧桿菌乳 亞種（Bifidobacteriumanimalis subsp. Lactis)，該菌株的純培養(yǎng)物已于 2014 年 12 月 18 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，該中心地址是：中國 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101 ;保藏編 號為CGMCC NO. 10225,簡稱為動物雙歧桿菌乳亞種BZ25。
2. 如權利要求1所述的香豬源性降膽固醇、耐氧雙歧桿菌BZ25,其特征在于所述 桿菌BZ25的形態(tài)特征及生理生化特征菌均接近于雙歧桿菌屬，其16S rRNA基因序列 與動物雙歧桿菌乳亞種（AiAWoAacteria? subsp. Zacii1S)的 16S rRNA 序 列同源性在99%以上，根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》中雙歧桿菌屬的分類規(guī)定，動物 雙歧桿菌乳亞種BZ25屬于放線菌門（Actinobacteria)、放線菌綱（Actinobacteria)、 放線菌亞綱（Actinobacteridae)、雙歧桿菌目（Bifidoacteriales)、雙歧桿菌 科（Bifidobacteriaceae)、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)，動物雙歧桿菌乳亞種 {Bifidobacterium animal is subsp. Lactis)。
【專利摘要】一株香豬源性降膽固醇、耐氧雙歧桿菌BZ25，該菌株為動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacterium？animalis？subsp.Lactis)，該菌株純培養(yǎng)物于2014年12月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，該中心地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101；保藏編號為CGMCC？NO.10225，簡稱為動物雙歧桿菌乳亞種BZ25。該菌株不僅降膽固醇能力高、耐酸受性、耐膽鹽受性、耐氧性能良好和具有益生特性，能作為益生菌添加到發(fā)酵乳制品中使其成為功能性食品，豐富了雙歧桿菌菌種資源，對雙岐桿菌保健產品的開發(fā)有積極意義。CGMCC NO.1022520141218
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-01, A23C9-12
【公開號】CN104560829
【申請?zhí)枴緾N201510018130
【發(fā)明人】何臘平, 張玲
【申請人】貴州大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月14日