一種解淀粉芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及功能微生物篩選技術領域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其在植物 病害防治中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著植物種類的不斷增多，植物栽培方式的不斷多樣化，植物病害日趨嚴重，而傳 統(tǒng)的化學防治方法存在著許多弊端，比如：化學農藥的大量使用引起了嚴重的環(huán)境污染，農 產品的農藥殘留也越來越嚴重，病菌抗藥性產生速度也越來越快等一系列對人們生活有害 的影響。在當今倡導低碳經濟、環(huán)保節(jié)約型社會中，尋求既能保護人類生活，又可增產的新 技術十分適應當今社會的發(fā)展。
[0003] 生物防治方法是利用生物多樣性達到有害生物的可持續(xù)控制和無公害治理，符合 當今社會的發(fā)展和要求，有著廣闊的應用前景。其中，微生物防治主要是利用有益的微生 物，通過生物間的競爭作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及誘導抗性等，來抑制某些病原 物的存活和活動，即利用生態(tài)系統(tǒng)中各種生物之間相互依存、相互制約的生態(tài)學現(xiàn)象和某 些生物學特性，以一種或一類生物或其產物抑制另一種或另一類生物。簡言之，以菌治蟲， 以菌治病，其優(yōu)越性在于資源豐富，選擇性強、無殘留、無污染、成本、低、兼防兼治增產增 收，保持生態(tài)平衡，起到長效的作用。所以開發(fā)微生物農藥有廣闊的應用前景。（張麗，張書 娥；2010年）
[0004] 目前研宄發(fā)現(xiàn)，可用于生物防治的微生物主要包括真菌、細菌、放線菌和酵母菌等 微生物種群。但是，生防微生物對農藥的反應敏感，種類比較單一，抗菌譜較窄，且在植株上 定殖較難，生防效果不穩(wěn)定，都限制了其在植物領域的廣泛應用。因此，進一步開發(fā)廣譜抗 菌、生防效果穩(wěn)定的微生物資源迫在眉睫。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株解淀粉芽孢桿菌及其在植物病害防治中的應用。所述解 淀粉芽孢桿菌篩選自草莓根際土壤，對羽衣草單囊殼菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、葡萄孢 菌等病原菌均有很強的抑制能力，可有效防治白粉病、枯萎病、褐斑病、果腐病、灰霉病等常 見植物病害，效果顯著。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種解淀粉芽孢桿菌VLD-3 (Bacillus amyloliquefaciens VLD-3)，已于2015年1月30日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保 藏號為 CCTCC NO :M2015075。
[0007] 本發(fā)明另一方面提供了一種微生物制劑，包含上述解淀粉芽孢桿菌VLD-3。
[0008] 所述微生物制劑還包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、堅強芽孢桿 菌、蠟樣芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和黑曲霉中的任意一種或兩種或多種的組合。
[0009] 所述微生物制劑中解淀粉芽孢桿菌VLD-3的活菌量至少為IO7CFUAiI。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述微生物制劑在植物病害防治中的應用。
[0011] 所述植物病害包括白粉病、灰霉病、枯萎病、褐斑病和果腐病中的任意一種。
[0012] 有益效果
[0013] 本發(fā)明篩選到的解淀粉芽孢桿菌VLD-3能顯著抑制羽衣草單囊殼菌、葡萄孢菌、 尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌等病原菌的生長繁殖。所述菌株能有效預防草莓白粉病的發(fā)生， 實驗組草莓的病情指數(shù)遠遠低于對照組，且當解淀粉芽孢桿菌VLD-3菌液稀釋至700倍 時，實驗組草莓的病情指數(shù)仍低于8%，防治效率高達91.8% ;此外，所述菌株對白粉病疫 情較重的草莓和灰霉病疫情較重的黃瓜均有顯著的治療效果，50倍稀釋后的解淀粉芽孢桿 菌VLD-3菌液可使草莓的白粉病病情指數(shù)降低至14. 2%，黃瓜的灰霉病病情指數(shù)降低至 13. 2%，而對照組的病情指數(shù)已普遍高于96%，取得了意料不到的技術效果。本發(fā)明所述解 淀粉芽孢桿菌VLD-3可單獨作為生防菌劑應用于植物病害的預防和治療，也可以與其他具 有抑菌作用的芽孢桿菌、霉菌等組合成復合菌劑，對植物白粉病、灰霉病、褐斑病、果腐病等 植物病害的防治效率達到85% -90%，應用前景廣闊。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。對于實施例中所用到的具體方法或材 料，本領域技術人員可以在本發(fā)明技術思路的基礎上，根據已有的技術進行常規(guī)的替換選 擇，而不僅限于本發(fā)明實施例的具體記載。
[0015] 本發(fā)明所選用的設備和試劑可以選自市售任意一種。
[0016] 實施例1菌株的分離篩選與鑒定
[0017] 1.芽孢桿菌初篩
[0018] 采集青島市嶗山區(qū)北宅種植基地的草莓植株根際土壤10g，放入盛有40ml滅菌水 的三角燒瓶中；震蕩混勻后，將上清液轉移至新的滅菌試管；將試管經80°C水浴20min處 理，殺死非孢營養(yǎng)型細胞；將上述溶液稀釋20倍后，吸取100 μ 1涂布于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上， 37°C培養(yǎng)12h。將形態(tài)相異的菌落經平板劃線純化出單菌落后，移入營養(yǎng)肉湯斜面，37°C培 養(yǎng)12h，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 采用上述篩選分離方法，共獲得23株芽孢桿菌。
[0020] 2.抑菌實驗
[0021] (1)芽孢桿菌菌液制備：
[0022] 將分離得到的23株芽孢桿菌分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng) 12h ;(2)病原菌制備：
[0023] 將尖孢鐮刀菌或立枯絲核菌（由青島農業(yè)大學贈送）的菌塊（Φ7mm)接于PDA固 體培養(yǎng)基中央，30°C培養(yǎng)7d ;
[0024] (3)平板拮抗法初篩：
[0025] 在PDA固體培養(yǎng)基的中央接種尖孢鐮刀菌或立枯絲核菌菌塊（Φ7πιπι);然后，在距 培養(yǎng)皿中央25mm的對稱兩側點接上述篩選到的芽孢桿菌菌液，每株芽孢桿菌設3個平行。 將接種上病原菌和芽孢桿菌的平板放入30°C培養(yǎng)箱，72h后觀察發(fā)現(xiàn)，共有8株芽孢桿菌的 周圍形成明顯的抑菌帶，分別將其命名為VLD-1，VLD-2, VLD-3，……，VLD-8。
[0026] (4)打孔擴散法復篩：
[0027] 將滅菌后的PDA培養(yǎng)基溫度保持在55°C，然后用無菌水輕輕沖洗病原菌（尖孢鐮 刀菌或立枯絲核菌）斜面獲得病原菌孢子懸液，并取適量加入PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒平 板。待凝固后，即制得病原菌含量約為l〇7cfu/ml的PDA固體培養(yǎng)基。用牛津杯在距培養(yǎng) 皿中央25mm的對稱兩側各打一個孔（Φ7πιπι)，并加入150μ1待測芽孢桿菌（VLD-l，VLD-2， VLD-3,……，VLD-8)的菌液于孔內，每株芽孢桿菌設3個平行。將平板放入30°C培養(yǎng)箱， 72h后測量抑菌圈的直徑。結果顯示，加入芽孢桿菌VLD-3菌液的平板的抑菌圈直徑最大， 從而可以說明，本發(fā)明篩選到的8株芽孢桿菌中VLD-3的抑菌效果最強。
[0028] 3.菌株鑒定
[0029] 將芽孢桿菌VLD-3進行分子生物學鑒定，測得其16s rRNA序列，并通過NCBI BLAST比對，最終確認該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，將其命名 為解淀粉芽抱桿菌 VLD_3(Bacillus amyloliquefaciens VLD-3)，并于 2015年 1 月 30 日保 藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO !M2015075。.
[0030] 實施例2解淀粉芽孢桿菌VLD-3抑菌實驗
[0031] 將羽衣草單囊殼菌、葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌4種病原菌菌塊 (Φ IOmm)分別置于PDA固體培養(yǎng)平皿（Φ90πιπι)的中央；用直徑為60mm的無菌空白平皿 (Φ60πιπι)的邊緣蘸取活菌濃度為10 9cfu/ml的解淀粉芽孢桿菌VLD-3菌液后，在上述PDA 固體培養(yǎng)平皿中的病原菌塊周圍進行環(huán)形接種?？瞻讓φ战M則是用無菌水進行環(huán)形接種。 將接種后的PDA固體培養(yǎng)平皿置于30 °C培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)66h、90h、120h和190h時，測 量病原菌塊的直徑，利用以下公式計算抑菌率，具體結果見表1。
[0032] 抑菌率（％) = (1-(處理組病原菌斑直徑/對照組病原菌斑直徑））X 100
[0033] 表1解淀粉芽孢桿菌VLD-3對病原菌的抑菌效果
[0034]
【主權項】
1. 一種解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，所述的解淀粉芽孢桿菌的保藏號為CCTCC NO : M2015075。
2. -種微生物制劑，其特征在于，所述的微生物制劑包含權利要求1所述的解淀粉芽 孢桿菌。
3. 如權利要求2所述的微生物制劑，其特征在于，所述的微生物制劑包含枯草芽孢桿 菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和黑曲霉 中的任意一種或兩種或多種的組合。
4. 如權利要求2或3所述的微生物制劑，其特征在于，所述的微生物制劑中權利要求1 所述的解淀粉芽孢桿菌的活菌量至少為IO7 CFU/ml。
5. 權利要求2或3所述的微生物制劑在植物病害防治中的應用。
6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的植物病害為白粉病、灰霉病、枯萎病、 褐斑病和果腐病中的任意一種。
【專利摘要】本發(fā)明涉及功能微生物篩選技術領域，具體提供了一種解淀粉芽孢桿菌菌株，保藏編號為CCTCC NO：M2015075。所述解淀粉芽孢桿菌能顯著抑制羽衣草單囊殼菌、葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌等病原菌的生長繁殖，有效防治草莓白粉病、黃瓜灰霉病等植物病害，效果顯著。發(fā)明所述解淀粉芽孢桿菌可單獨作為生防菌劑應用于植物病害的預防和治療，也可以與其他具有抑菌作用的芽孢桿菌、霉菌等組合成復合微生物制劑，對白粉病、灰霉病、褐斑病、果腐病等植物病害的防治效率達到85%-90%，應用前景廣闊。CCTCC NO: M 201507520150130
【IPC分類】C12R1-125, C12R1-07, A01N63-04, A01P3-00, C12R1-085, C12R1-685, C12N1-14, C12N1-20, A01N63-00, C12R1-11
【公開號】CN104560837
【申請?zhí)枴緾N201510054680
【發(fā)明人】宗睿, 苑偉偉, 劉魯民
【申請人】青島蔚藍生物集團有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年2月2日