一種四氫嘧啶高產(chǎn)大腸桿菌工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 四氫啼陡（1，4, 5, 6-tetrahydr〇-2-methyl-4-pyrimidineca;rboxylic acid ; ectoine)是一種在耐鹽及嗜鹽微生物中應(yīng)用最為廣泛的滲透壓調(diào)節(jié)物。四氫嘧啶分子具有 高度水溶性、不帶電荷的特點(diǎn)，在高鹽環(huán)境下細(xì)胞可通過四氫嘧啶的高濃度積累提高胞內(nèi) 滲透壓，卻不會影響胞內(nèi)生物大分子正常的生理功能。研究表明在高鹽、高溫、冷凍和干燥 等逆境下四氫嘧啶對核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜及整個(gè)細(xì)胞可提供保護(hù)作用，因此在生物制劑、 化妝品生產(chǎn)和制藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 傳統(tǒng)的四氫啼陡生產(chǎn)工藝是利用嗜鹽細(xì)菌延長鹽單胞菌（Halomonas elongata) 可以分泌合成四氫啼陡的特性，采用"細(xì)菌擠奶（Bacterial milking)"的工藝通過高鹽誘 導(dǎo)合成、低鹽釋放，滲透壓多次循環(huán)沖擊實(shí)現(xiàn)四氫嘧啶的高效分泌合成。該方法對反應(yīng)器 材料的穩(wěn)定性有較高要求，而且這種不連續(xù)的生產(chǎn)流程及高濃度的鹽增加了下游純化工藝 的難度，另外高濃度的鹽易對設(shè)備造成腐蝕，同時(shí)還會影響菌體的生長，影響四氫嘧啶的產(chǎn) 量，導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加，影響了四氫嘧啶的大規(guī)模應(yīng)用。
[0004] 目前現(xiàn)有的生產(chǎn)菌株及方法嚴(yán)重制約了四氫嘧啶的工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用，因 此開發(fā)一株新型的四氫嘧啶高產(chǎn)菌株從而簡化生產(chǎn)工藝、提高合成效率、降低生產(chǎn)成本，對 四氫嘧啶的應(yīng)用有重要的實(shí)踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種四氫嘧啶高產(chǎn)大腸桿菌工程菌。
[0006] 本發(fā)明提供的大腸桿菌工程菌具體為含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段 的重組大腸桿菌或重組載體：
[0007] 1)序列表中SEQ ID Ns :1所示的核苷酸序列；
[0008] 2)編碼序列表中SEQ ID Ns :2、SEQ ID Ns :3和/或SEQ ID Ns :4所示蛋白質(zhì)序列 的多核苷酸序列；
[0009] 3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列；
[0010] 4)與1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以 上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0011] 所述重組大腸桿菌具體為將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)大腸桿菌后得到的重組菌。
[0012] 所述重組載體具體為在出發(fā)載體pBAD/HisA的多克隆位點(diǎn)插入具有SEQ ID Ns :1 所示核酸序列的DNA片段所得的質(zhì)粒；所述出發(fā)大腸桿菌具體為大腸桿菌；具體的，所述出 發(fā)大腸桿菌為帶有AaraBAD阿拉伯糖代謝缺陷性狀的大腸桿菌；再具體的，所述出發(fā)大腸 桿菌為大腸桿菌 BW25113 (rrnB3 Λ lacZ4787hsdR514 Λ (araBAD) 567 Λ (rhaBAD) 568rph-l)。
[0013] 所述重組載體具體為pBAD-EctABC，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID Ns . 5所 /Jn 〇
[0014] 所述重組大腸桿菌具體為大腸埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC CGMCC NO. 8334〇
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述任一所述的重組大腸桿菌或重組載體在制備四 氫嘧啶中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種制備四氫嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸鈉 的溶液中加入上述任一所述的重組大腸桿菌，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后即得；其中，所述重組大腸 桿菌是表達(dá)了經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)SEQ ID Ns :2所示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4 所示蛋白的。
[0017] 所述誘導(dǎo)包括用L-阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0018] 所述誘導(dǎo)包括用含lg/L的L-阿拉伯糖的發(fā)酵液進(jìn)行誘導(dǎo)；和/或，所述誘導(dǎo)前， 菌體溶液的0D600值為0. 6-0. 8 ;和/或，所述誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)酵條件為30°C培養(yǎng)6-8小時(shí)；優(yōu)選 的，培養(yǎng)6小時(shí)。
[0019] 所述含L-天冬氨酸鈉的溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及其在所述含L-天冬氨酸 鈉的溶液中的濃度如下：
[0020] L-天冬M酸鈉 200m\f； 葡萄糖 l〇g/L; IH由 l〇g/L; KCl 10g/L；
[0021] 溶劑為lOOmM、ρΗ7· 0的PBS緩沖液。
[0022] 所述lOOmM、ρΗ7. 0的PBS緩沖液是由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制而成的，具體 為，每IL所述ρΗ7. 0的PBS緩沖液由380ml0. IM磷酸二氫鈉水溶液加入620ml0. IM磷酸氫 二鈉水溶液配制而成。
[0023] 所述生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的反應(yīng)條件為30°C ;和/或，在加入權(quán)利要求1-4任一所述的 重組大腸桿菌后，可調(diào)節(jié)菌體溶液〇D_值達(dá)到10。
[0024] 所述生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，還需進(jìn)行胞內(nèi)和/或胞外四氫嘧啶的抽提；
[0025] 所述胞內(nèi)四氫嘧啶的抽提包括：生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，離心收集菌體后凍干，將凍干菌 體加入體積比為10:5:4的甲醇、氯仿、水組成的抽提液中震蕩1小時(shí)，離心取上清，上清液 中加入等體積的氯仿與水的混合液，氯仿與水的體積比為1:1，振蕩1小時(shí)，離心取上層水 相，干燥除水后即得；
[0026] 所述胞外四氫嘧啶的抽提包括：生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，離心收集液相，加入等體積氯仿 振蕩1小時(shí)，離心取上清，移除溶劑后即得。
[0027] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用上述任一所述的重組大腸桿菌制備四氫嘧 啶的生物反應(yīng)液，其組成包括：
[0028] Ir 舊9ΛΜ 200m?; 葡·唐 l〇g/U Irtt 丨 Og/L; KCl !Og/L；
[0029] 溶劑為lOOmM、ρΗ7· O的PBS緩沖液。
[0030] 所述lOOmM、pH7. O的PBS緩沖液是由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制而成的，具體 為，每IL所述pH7. 0的PBS緩沖液由380ml0. IM磷酸二氫鈉水溶液加入620ml0. IM磷酸氫 二鈉水溶液配制而成。
[0031] 為了避免傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的缺陷，本發(fā)明將嗜鹽菌來源的四氫嘧啶合成基因簇導(dǎo)入 非嗜鹽微生物大腸桿菌中，重構(gòu)四氫嘧啶的合成通路。本發(fā)明成功構(gòu)建了延長鹽單胞菌 Halomonas elongate四氫啼陡合成基因簇EctABC的大腸桿菌表達(dá)載體pBAD-EctABC及 K-12系列重組表達(dá)菌株BW-pBAD-ectABC。其中四氫嘧啶合成中的三個(gè)關(guān)鍵酶：氨基丁酸 乙酰基轉(zhuǎn)移酶（EctA)、二氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶（EctB)、四氫嘧啶合成酶（EctC)，在阿拉伯 糖啟動子的調(diào)控下均實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體以天冬氨酸鈉為前體通過生物 轉(zhuǎn)化的方法實(shí)現(xiàn)了四氫嘧啶的高效分泌型合成。每克菌體可以合成1. 1克四氫嘧啶，其中 超過90 %的四氫嘧啶分泌至胞外。
[0032] 本發(fā)明首次利用延長鹽單胞菌Halomonas elongate四氫啼陡合成基因簇EctABC 實(shí)現(xiàn)了四氫嘧啶在大腸桿菌中的高效分泌合成，結(jié)合以L-天門冬氨酸鈉為催化底物的生 物轉(zhuǎn)化方法，單位菌體的四氫嘧啶合成效率顯著高于其它現(xiàn)有菌株，合成量達(dá)到已報(bào)道的 最高水平，且絕大部分產(chǎn)物分泌至胞外，便于產(chǎn)物的下游純化分離。因此本發(fā)明對四氫嘧啶 的工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用具有重大意義。
【附圖說明】
[0033] 圖1為SDS-PAGE分析四氫嘧啶合成基因簇EctABC在大腸桿菌中的表達(dá)情況。
[0034] 圖2為大腸桿菌四氫嘧啶高產(chǎn)菌株BW-pBAD-ectABC中四氫嘧啶合成水平的分析。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037] 延長鹽單胞菌Halomonas elongate CGMCC No. 1. 6329購自中國普通微生物菌種 保藏管理中心（CGMCC)。
[0038] pBAD/HisA 購自 invitrogen，產(chǎn)品目錄號為 V430-01 ;
[0039] 實(shí)施例1、大腸桿菌四氫嘧啶高產(chǎn)菌株BW-pBAD-ectABC的構(gòu)建 [0040](一）、四氫嘧啶合成基因簇EctABC在大腸桿菌中的表達(dá)
[0041] I、PCR擴(kuò)增四氫嘧啶合成基因簇EctABC的編碼序列
[0042] 以延長鹽單胞菌H.elongate(CGMCC No. 1.6329)的基因組DNA為模板，用引物 EctABC-Pl、EctABC-P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0043] EctABC-Pl :5' ~CCTAGCTAGCATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTA~3,
[0044] EctABC-P2 :5' -CCGCTGCAGTTACAGCGGCTTCTGGTCGTCGGCT-3'
[0045] 2、酶切、連接
[0046] 用NheI和PstI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)先使用NheI和PstI雙酶切的pBAD/ HisA質(zhì)粒大片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒。
[0047] 3、轉(zhuǎn)化、篩選以及序列驗(yàn)證
[0048] 用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法將上述制備的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci，用含有氨芐 青霉素（100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取單菌落，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和提取質(zhì)粒， 進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果表明，上述制備的重組質(zhì)粒中含有具有如序列表中的SEQ IDNs. 1 所示核酸序列（即EctABC編碼基因序列）的DNA片段，該序列分別編碼具有序列表中SEQ ID N2 . 2-4所示氨基酸序列的3種蛋白（即四氫嘧啶合成中的三個(gè)關(guān)鍵酶：氨基丁酸乙?；?轉(zhuǎn)移酶EctA、二氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶EctB、四氫嘧啶合成酶EctC)，與已報(bào)道的序列一致。 上述實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果證明構(gòu)建的質(zhì)粒及重組菌正確。將陽性克隆記作DH5 a -pBAD-ectABC， 陽性質(zhì)粒記作pBAD-EctABC。質(zhì)粒pBAD-EctABC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID Ns . 5 所示。
[0049] 4、重組表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0050] 用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pBAD-EctABC轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K-12系列表達(dá)菌 株 BW25113(rrnB3 ΛlacZ4787hsdR514 Λ (araBAD)567 Λ (rhaBAD)568rph-l)(購自 Thermo Cat#0EC5042)，用含有氨芐青霉素（100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取單菌落，獲 得EctABC重組表達(dá)菌株。檢測重組菌株合成四氫嘧啶的能力，將其中合成能力較差的一株 重組菌命名為大腸桿菌（Escherichia coli)