殺鮭氣單胞菌活疫苗制劑和凍干疫苗制品的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種殺鮭氣單胞菌活疫苗制劑和凍干疫苗制品的制備方法及應(yīng)用，具 體涉及基于一種殺鮭氣單胞菌無標(biāo)記基因缺失減毒突變株的制劑及應(yīng)用，該疫苗株主要用 于由殺鮭氣單胞菌引發(fā)的魚類疥瘡病的免疫防治，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害免疫防控領(lǐng)域， 具體屬于漁用細(xì)菌性基因缺失減毒活疫苗技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 殺鮭氣單胞菌（Jerofflmas 屬于氣單胞菌科（Jerofflmat/aceae)氣 單胞菌屬（Xeroffioaas),是一種革蘭氏陰性短桿菌，最適生長溫度為18~22°C。由殺鮭氣單 胞菌引起的癤瘡病（Furuneulosis)是鮭科魚類養(yǎng)殖業(yè)的重大病害（Janda J.M. ei a乂， 2010，ClinMicrobiol Rev, 23:35-73.)，嚴(yán)重影響了世界范圍內(nèi)以大西洋鮭（feho sahr )為代表的鮭魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，是海水魚類養(yǎng)殖業(yè)中最為重大的風(fēng)險之一，世 界動物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health，0IE)將其列為重點疫病目錄。 除此該菌還能感染絕大部分其他鮭鱒魚類，如，太平洋鮭（Pacific salmon)、楓葉鮭、虹鱒 (Rainbow trout)、銀鮭（Coho salmon)等，和非鮭轉(zhuǎn)魚類，如金魚（Goldfish)、鯉（Common carp)、lt(Catfish)和大菱鲆（Turbot)等，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失（Bergh 0.，2008，F(xiàn)ish Diseases. Science Publishers, PP. 239-277.)。
[0003] 鑒于殺鮭氣單胞菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的重大危害，人們在過去近40年的以鮭魚 養(yǎng)殖業(yè)為代表的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展中，不斷探索針對殺鮭氣單胞菌病害的高效防治策 略。以抗生素為核心的化學(xué)療法曾伴隨著世界范圍內(nèi)以海水魚類養(yǎng)殖為代表的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè) 發(fā)展歷程，為病害防治和減少病害損失發(fā)揮過積極貢獻(xiàn)。但這種病害防控策略所導(dǎo)致抗藥 病原快速蔓延，水產(chǎn)品安全問題(藥物殘留）和環(huán)境污染的負(fù)面影響日趨嚴(yán)重。抗生素的大 量使用和濫用所帶來的負(fù)面影響已經(jīng)給世界范圍水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了 嚴(yán)重制約。
[0004] 而基于魚類免疫系統(tǒng)的預(yù)防性疫病防控措施則是一種非常有效的符合環(huán)境友好 的病害防控策略。疫苗作為一種預(yù)防性手段，因其可以使宿主長久地抵抗病原體的感染而 被引入水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。從魚疫苗的研發(fā)歷程和當(dāng)前發(fā)展趨勢看，魚類疫苗大致可以分為四種 類型：1)以病原體全細(xì)胞為基礎(chǔ)的滅活疫苗；2)以全細(xì)胞為基礎(chǔ)的減毒活疫苗；3)以具 有抗原活性的亞細(xì)胞成分為基礎(chǔ)的亞單位疫苗；4)以抗原活性成分的編碼基因為基礎(chǔ)的 DNA疫苗。目前，國際上已商品化的魚類細(xì)菌疫苗基本為滅活疫苗（Bj0rnE. B.，ei a乂， 2013， Fish Shellfish Immunol, 35:1759-1768)。
[0005] 與滅活疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗相比，由于病原體減毒活菌具有完整的免疫 原組分，較滅活病原菌具有更強的細(xì)胞免疫潛能，可誘導(dǎo)產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)；同 時，其仍然保持的侵染性可使減毒活菌可通過口服和浸泡途徑免疫，以此開發(fā)的減毒活疫 苗在經(jīng)濟上更具競爭性。由于減毒活疫苗兼具高效、給藥方便、經(jīng)濟低廉等綜合優(yōu)勢，這對 于需要免疫成千上萬數(shù)量的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)來說具有現(xiàn)實的商業(yè)應(yīng)用潛力。
[0006] 根據(jù)減毒原理的不同，減毒活疫苗可以分為多種不同類型。其中利用同屬不同種 的微生物作為減毒株、傳代減毒株、病原自然弱毒株、改變體外培養(yǎng)傳代的環(huán)境減毒株或是 轉(zhuǎn)座子等基因重組技術(shù)開發(fā)的減毒株，大都具有兩個先天致命的缺陷：1)攜帶抗性標(biāo)記和 外源基因片段對環(huán)境有潛在危害；2)易回復(fù)突變，恢復(fù)毒力。毒力易回復(fù)和不可控的環(huán)境 傳播風(fēng)險是這些疫苗應(yīng)用所必須重視和解決的。鑒于此，該類減毒疫苗被包括中國在內(nèi)的 各國生物制品安全檢查管理機構(gòu)審批法規(guī)認(rèn)定為具有較高環(huán)境安全風(fēng)險的生物制品，因而 難以進(jìn)入商業(yè)化開發(fā)進(jìn)程。
[0007] 為了消除基因重組疫苗產(chǎn)品的環(huán)境安全潛在危害，無標(biāo)記基因缺失突變技術(shù)發(fā)展 為近年來國際上構(gòu)建基因缺失減毒活疫苗的先進(jìn)開發(fā)技術(shù)（Golovliovl.，ei a/.，2003， FEMS MicrobiolLett, 222:273-280)。該技術(shù)構(gòu)建的減毒活疫苗與以往傳統(tǒng)技術(shù)路線構(gòu) 建的減毒活疫苗相比具有如下優(yōu)點：1)開發(fā)出的減毒活疫苗不攜帶抗性標(biāo)記和外源基因片 斷；2)采用基因定向框內(nèi)大片斷缺失，突變和毒力不可回復(fù)；3)突變構(gòu)建的遺傳背景清楚， 減毒機理明確。這些都為無標(biāo)記減毒活疫苗的環(huán)境安全控制提供了更加有力的保障。由于 具有公認(rèn)的產(chǎn)品和環(huán)境安全性，基因無標(biāo)記缺失減毒疫苗已成為目前國際上流行的活疫苗 構(gòu)建技術(shù)，是疫苗開發(fā)的國際前沿領(lǐng)域與主要發(fā)展方向之一。
[0008] 基因缺失減毒活疫苗構(gòu)建開發(fā)策略中的基因缺失是其技術(shù)關(guān)鍵所在，目前主要采 用兩種途徑選擇缺失靶基因：1)選擇缺失病原菌已知的毒力因子相關(guān)編碼基因；2)選擇涉 及病原菌在宿主體內(nèi)定值和存活相關(guān)的已知代謝途徑關(guān)鍵功能基因。
[0009] 營養(yǎng)缺陷型（Auxotrophy)細(xì)菌是一種需要補充一種或幾種生長因子才能存活和 增殖的營養(yǎng)突變體，而某些營養(yǎng)因子在脊椎動物組織中是有限可用的。同時，現(xiàn)代分子生 物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對魚類病原致病機制的不斷深入了解使人們認(rèn)識到許多在宿主內(nèi)存活 和增殖所必需的功能基因。這些都為減毒疫苗的構(gòu)建提供了潛在的目的缺失靶基因。以 芳香代謝產(chǎn)物生物合成缺陷為靶點（如aro兒arM突變株）的減毒突變株構(gòu)建成 為魚類開發(fā)中的可行技術(shù)路線（Wangei a7.，2013; Lienei a7.，2014)?；蛲?變技術(shù)路線的一個基本假設(shè)就是基于兩種芳香化合物對氨基苯甲酸和2, 3-二羥基苯甲酸 在宿主體內(nèi)是有限可用的，這種營養(yǎng)缺陷型已被用于人類和陸地動物減毒疫苗的開發(fā)中， 如霍亂、破傷風(fēng)、利什曼病和傷寒（Stocker B.A·，1988, Vaccine, 6:141-145; Ward S.J·， et ^7.,1999, InfectImmunj 67:2145-152, Malcova U. , et ah, 2009, FEMS Microbiol Lett，291 (I) :44-49)。國外有報道通過轉(zhuǎn)座子插入失活技術(shù)或無標(biāo)記基因缺失技術(shù)缺 失殺鮭氣單胞菌arW基因，成功構(gòu)建殺鮭氣單胞菌(殺鮭亞種)）減毒活疫苗（Vanghun aA，1993; Marsden a7.，1996)。尚未有缺失殺鮭氣單胞菌編碼分枝酸合成 酶）的報道。
[0010] 分支酸合成酶（Chorismate synthase)是細(xì)菌中莽草酸合成代謝途徑（Shikimate pathway)的合成酶，催化5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成分支酸，主要涉及芳香氨基酸的 生物合成（Pitchandi P·，a7·，2013，BMC Pharmacol Toxicol，14:29)，其功能編碼 基因!功能失調(diào)將導(dǎo)致生物體表現(xiàn)為對芳香氨基酸Phenylalanine、Tyrosine和 Tryptophan的營養(yǎng)缺陷型。沿^^^因及營養(yǎng)缺陷型已在大腸桿菌分 枝桿菌水稻白枯葉病菌（o/yzae)、沙門氏菌（5^7避?/?<977沒） 以及高等植物中進(jìn)行了深入研究（Betancor L.，ei a/·，2005，Vet Microbiol, 107(1-2):81-9; Song H·，2009，Methods Mol Biol, 465:279-95; Song E.S., et al. , 2012, Microbiol Res, 167(6):326-31; Maeda H., et al. , 2012, Annu Rev Plant Biol, 63:73-105)。
[0011] 有研究表明，病原菌染色體上aro?因的缺失突變將導(dǎo)致受體菌株表現(xiàn)為芳香 氨基酸營養(yǎng)缺陷表型，不能有效合成DNA及蛋白合成所需的葉酸及重要毒力因子鐵載體的 前體物質(zhì)2, 3-二羥基苯甲酸等，從而喪失毒力并極大削弱其在環(huán)境中的生存競爭力，無法 在宿主體內(nèi)增殖存活（Chen Q.，ei ，1994, JBacteriol, 176:4226-4234)。
[0012] III型分泌系統(tǒng)為革蘭氏陰性病原菌中一類重要的毒力因子（Corneliset al.， 1998; Galan& Collmer, 1999; Nhieu& Sansonetti, 1999)。Burr 等人鑒定出殺鮭氣單胞 菌的ΠΙ型分泌系統(tǒng)（Burr et al.，2002，2003)。