缺失phoP的鴨疫里默氏桿菌CH1減毒菌株及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及缺失#〇扣勺鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌 株及構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨疫里默氏桿菌RA)主要引起傳染性楽膜炎，侵 害包括雛鴨、鵝等多種禽類，表現(xiàn)為急性或慢性、敗血性、接觸性傳染病。在我國主要流行血 清型有血清1型，2型和10型。鴨傳染性漿膜炎主要在10-35日齡的雛鴨發(fā)病，發(fā)病率可 達90 %以上，死亡率為5 % -75 %，耐過鴨導致動物出現(xiàn)生長緩慢，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的 經(jīng)濟損失。目前，鴨疫里默氏桿菌病的防治主要依靠抗生素治療，然而隨著多種藥物耐藥性 的不斷增加以及對食品安全性等問題的考慮，疫苗免疫是控制疫病發(fā)生與傳播的最經(jīng)濟、 最有效的手段。國內(nèi)對于滅活疫苗的研究較多，如鴨傳染性漿膜炎滅活苗、鴨疫里默氏桿菌 和大腸桿菌蜂膠二聯(lián)滅活苗、鴨疫里默氏桿菌多價滅活苗研制等，而且市場上已經(jīng)有針對 血清1型，2型和10型的滅活疫苗在銷售。而這些疫苗存在缺陷：如應用比較廣泛的油乳 劑滅活苗無法提供完全保護（70%左右的保護率）且存在注射吸收不理想，毒株覆蓋不完全 等問題，研制新的、高效、覆蓋多種血清型的鴨傳染性漿膜炎疫苗成為我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的迫 切需求。
[0003] 位于膜上的遲白構(gòu)成雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與一系列生物學過程，包括 調(diào)控毒力基因的表達、增強細菌對多種限制性生長環(huán)境，如低Mg2+、低酸、氧化物、金屬離 子、鹽的的適應能力、激活廣譜抗生素的耐藥性、增強細菌的免疫逃避能力，如因激 活的可以裂解α-螺旋的多肽C18G。而在鴨疫里默氏桿菌中全局調(diào)控基因開究 尚未見報道。現(xiàn)有技術(shù)也沒有報道通過對# 〇用女造是否可以獲得減毒菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供一株缺失#0/?勺鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌株，該減毒 菌株敲除了 #0/?因片段；所述因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，該減 毒菌株的分類命名為/PieffiereJ7a aflaiipesii/er CHlA/7Α0Λ保藏于武漢市武昌洛珈山的 中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學），保藏號為CCTCC M 2014557,保藏時間為2014年11 月07日。
[0005] 所述減毒菌株中的因片段由沖％抗性基因所替代。
[0006] 所述壯觀霉素抗性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供缺失#0/?勺鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌株的構(gòu)建方法。 該方法包括如下步驟： 1) 構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pREl 12- Δ : 2) 將步驟1)所得重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入到x7213大腸桿菌中； 3) 將步驟2)中含有重組質(zhì)粒的x7213大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌CHl菌自然結(jié)合，使 同源臂導入鴨疫里默氏桿菌CHl菌的基因組中，經(jīng)過同源臂交換和壯觀霉素抗性篩選得到 陽性克隆； 4)通過PCR篩選得到缺失因的鴨疫里默氏桿菌CHl減毒菌株。
[0008] 所述步驟3)中，將含有重組質(zhì)粒的X7213大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌CHl菌自 然結(jié)合時，具體的結(jié)合步驟為：分別將含有重組質(zhì)粒X7213菌株與 鴨疫里默氏桿菌CHl培養(yǎng)至OD6qq=O. 6-0. 8,按體積比3:2的比例，在固體平板培養(yǎng)基上混 合，37°C下，于5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，將菌苔刮下，劃線于含有50μ g/ml的和 150 μ g/m的的胰蛋白大豆肉湯固體平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，挑取生長的單菌落。
[0009] 所述步驟4)中，PCR篩選的步驟為： (1) 鴨疫里默氏桿菌CHl保守序列引物 F ： CATGCCATGGTGAGACAACTTAAAATTACC R ：CGCGGATCCTTTTCCTAAATAAGACTTC PCR擴增鴨疫里默氏桿菌CHl的特異性基因的864bp片段，判定候選突變株是否為鴨疫 里默氏桿菌CHl ; (2) 以抗性基因的引物 Spec-F ：GCACCTGCAGGGACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG 擴增抗性片段的1185bp片段，判斷是否發(fā)生基因的替換； (3) 以引物 phoP-up-F ：ACAGGAAATAGATAAACAAG phoP-down-R ：GGCCAAGATGATACATCAACG 進行擴增以檢測替換片段是否正確； (4) 以引物 phoP-F:CATGCCATGGTGCAAAAAATATTAATTG phoP-R:CGCGGATCCTTTTTTAACAAAGTTGGAA 擴增目的基因以檢測是否#〇/^是否被缺失。
[0010] 所述重組自殺質(zhì)粒PRE112- : 的構(gòu)建方法，包括如下步驟： 因的左右同源臂的引物設(shè)計： phoP-up-F ：ACAGGAAATAGATAAACAAG phoP-up-R ：CCTGCAGGATTGCGGCCGCAGAACAAAGATAGTTATATTT phoP-down-F ：GCGGCCGCATCCCTGCAGGTAACAAGAGAAATATTAGCC phoP-down-R ：GGCCAAGATGATACATCAACG 2) 以鴨疫里默氏桿菌CHl全基因組作為模板，分別對phoP基因的左右臂進行PCR擴 增，回收產(chǎn)物用引物phoP-up-F和phoP-down-R進行擴增，得到左右同源臂產(chǎn)物； 3) 利用加 A試劑盒對同源臂末端進行加 A處理，然后與用AhdI限制性內(nèi)切酶處理的 PRE112自殺質(zhì)粒產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入汰腸桿菌感受態(tài)中； 4) 將步驟3)所得C7232大腸桿菌搖菌培養(yǎng)至對數(shù)期，進行質(zhì)粒抽提，得到重組質(zhì)粒 pRE112-/7Ao/*;在 phoP-up-R 和 phoP-down-F 引物間引入 NotI 和 SbfI 酶切位點； 5) 抗性基因的引物設(shè)計 spec-F ：GCACCTGCAGG GACCAGCCAGGACAGAAA Spec-R ：ATGCGGCCGCCCACGTCAAATAATCAAGGCG ； 將抗性基因的引物進行PCR擴增，PCR擴增片段回收后用NotI和SbfI進行 雙酶酶切，再與經(jīng)NotI和SbfI雙酶酶切處理的pRE112-A#o/^接，得到重組質(zhì)粒 pREl 12- Δ :
[0011] 所述重組自殺質(zhì)粒pREm-A/^o/7: 的構(gòu)建方法的步驟2)中，對phoP基因 的左右臂進行PCR擴增時，具體PCR擴增條件為：先于94°C變性2 min，經(jīng)98°C變性10s、 55°C退火10s、72°C延伸15s，循環(huán)擴增35次，再于72°C延伸lOmin。
[0012] 所述步驟5)重組自殺質(zhì)粒pREld/^o/7: 的構(gòu)建方法的步驟2)中，對spec 抗性基因的引物進行PCR擴增時，具體PCR擴增條件為：先于94°C變性2min，經(jīng)98°C變性 10s、55°C退火10s、72°C延伸20s循環(huán)擴增35次，再于72°C延伸IOmin。
[0013] 由于口1^112-八/7力〇/?::5776^重組質(zhì)粒不能在狀中復制存活，將轉(zhuǎn)入有重組質(zhì)粒的 C7213菌株與RA結(jié)合，使同源片段導入RA基因組中，利用壯觀霉素抗性篩選得到陽性克隆。 再利用PCR方法鑒定得到突變株。
[0014] 藥敏試驗表明鴨疫里默氏桿菌CHl菌株天然就對很多抗生素不敏感，利用壯觀霉 素抗性基因片段進行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，具有較好效果。
[0015] 本發(fā)明的第三個目的是提供該減毒菌株在疫苗上的應用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果： 1、目前，對鴨疫里默氏菌的毒力因子認識較少，用于構(gòu)建鴨疫里默氏菌減毒菌株的方 法十分有限，本發(fā)明通過敲除鴨疫里默氏菌中的因，成功構(gòu)建了缺失因的鴨 疫里默氏桿菌CHl的減毒菌株。
[0017] 2、本發(fā)明構(gòu)建的減毒菌株可用于鴨疫里默氏桿菌基因減毒疫苗，用于研制預防多 個血清型的鴨疫里默氏桿菌的感染或者作為疫苗載體。
[0018] 3、本發(fā)明構(gòu)建的減毒菌株可用于對鴨疫里默氏桿菌基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，為后續(xù) 研究奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1 :是本發(fā)明中用于構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌桿菌因突變株示意圖，圖中， PhoP :鴨疫里默氏桿菌CHl #0/?因，B739-2186 :鴨疫里默氏桿菌CHl #0/?因上游鄰 近的讀碼框，B739-2188 :鴨疫里默氏桿菌因下游鄰近的讀碼框； 圖2 :為重組質(zhì)粒pREld/^o/7: : spec質(zhì)粒圖譜； 圖3 :為鴨疫里默氏桿菌變株構(gòu)建鑒定，其中1為保守序列擴增，2為壯觀霉素 抗性片段擴增，3為的基因擴增，4為ph〇P-up-F/ph〇P-up-R擴增野生株替換片段全 長； 圖4 :為鴨疫里默氏桿菌親本株生長曲線圖，其中，RA-CHl為野生株， RA-CHl Λ為本發(fā)明減毒菌株； 圖5 :是本發(fā)明中鴨疫里默氏桿菌突變株對鴨胚成纖維細胞侵襲力和粘附力的結(jié)果； 其中，左側(cè)Adherence代表粘附力實驗，右側(cè)invasion代表侵襲力實驗，RA-CHl為野生株， RA-CHl Λ #0/?本發(fā)明減毒菌株； 圖6 :為鴨疫里默氏桿菌突變株及親本株在動物機體組織載量測定，其中，左側(cè)Liver 代表是本發(fā)明減毒菌株RA-CHl 其親本株在接種后12h、24h肝臟中細菌組織載 量，右側(cè)Brain代表是RA-CHl 其親本株在接種后12h、24h大腦中細菌組織載量， phoP-12h和phoP-24分別為本發(fā)明減毒菌株接種12h和24h的載量，RA-12h和RA-24h分 別為親本株接種12h和24h的載量； 圖7 :是本發(fā)明中不同劑量鴨疫里默氏桿菌突變株對試驗動物生長的影響情況。其中 1 (phop-Ι)為免疫劑量6. I X IO9CFU組，2 (phop-2)為免疫劑量6. I X IO8CFU組，對照組1 為不免疫不攻毒，對照組2為不免疫但用10XLD5tl攻毒組。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021] 實施例1 鴨疫里默氏桿菌（RA-CHl)減毒菌株的制備： 所述的鴨疫里默氏桿菌為四川農(nóng)業(yè)大學禽病中心實驗室保存（RA-CH1)，所述的沙門氏 菌為鼠傷寒沙門氏菌UK-I 大腸桿菌為大腸桿菌工程菌，如c7232，c7213，c6212 等。
[0022] 第一步，鴨疫里默氏桿菌血清I (RA-CHl)潛在因功能鑒定，根據(jù)鼠傷