一種哺乳動物三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種哺乳動物三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法及應(yīng)用，屬于細(xì)胞 生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)元的分離培養(yǎng)，是研宄神經(jīng)元生長因子、軸突向外生長、分化以及感覺生理學(xué) 等的常用技術(shù)。盡管分離胚胎或新生動物神經(jīng)細(xì)胞形成突觸之前的神經(jīng)元要相對容易一 些，但胚胎神經(jīng)元與成熟神經(jīng)元在電生理學(xué)、發(fā)育、再生等方面有著不同的特性。因此對成 熟神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)在很多研宄中是非常必要的。但在神經(jīng)元原代培養(yǎng)過程中一直存在著細(xì) 胞產(chǎn)量和質(zhì)量都不高的問題。
[0003] 目前，現(xiàn)有的三叉神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)多為膠原酶消化法，其在培養(yǎng)過程中，有 些細(xì)節(jié)考慮不夠全面，如：在沒有〇)2平衡調(diào)節(jié)裝置時(shí)培養(yǎng)液的穩(wěn)定性不好，處理過程對組 織或細(xì)胞的影響較大，對細(xì)胞損傷較大，消化不夠徹底，雜質(zhì)細(xì)胞較多，培養(yǎng)所得細(xì)胞不純 等問題，因此細(xì)胞的產(chǎn)量和質(zhì)量都不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種哺乳動物三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外分離 培養(yǎng)方法及應(yīng)用，采用的技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種哺乳動物三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，該方 法是將哺乳動物三叉神經(jīng)組織置于含有L-15培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿上進(jìn)行清洗處理，剪碎后依 次用十一型膠原酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化處理，細(xì)胞篩過濾后對濾液進(jìn)行 密度梯度離心，懸浮后接種于包被好的細(xì)胞培養(yǎng)裝置內(nèi)，用基礎(chǔ)神經(jīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0006] 所述方法步驟如下：
[0007] 1)將所得的哺乳動物三叉神經(jīng)組織置于含L-15培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿上清洗后剪碎， 獲得預(yù)處理三叉神經(jīng)組織；
[0008] 2)將步驟1)所得預(yù)處理三叉神經(jīng)組織依次用十一型膠原酶、胰蛋白酶和胰蛋白 酶-EDTA進(jìn)行消化處理，經(jīng)過中和、離心和懸浮后用細(xì)胞篩過濾去除組織碎片，獲得細(xì)胞懸 浮液；
[0009] 3)步驟2)所得細(xì)胞懸浮液，對濾液進(jìn)行密度梯度離心，去除細(xì)胞碎片和雜細(xì)胞， 獲得純化細(xì)胞；
[0010] 4)將步驟3)所得純化細(xì)胞用基礎(chǔ)神經(jīng)培養(yǎng)基懸浮，然后接種到已經(jīng)包被好的細(xì) 胞培養(yǎng)裝置內(nèi)，在培養(yǎng)箱中用基礎(chǔ)神經(jīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24-48h獲得三叉神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞。
[0011] 步驟1)所述哺乳動物為除胚胎期和新生期以外的哺乳動物。
[0012] 優(yōu)選地，步驟1)所述哺乳動物為8-12周齡的大鼠。
[0013] 步驟2)所述消化處理過程為：（1)將步驟1)所得的預(yù)處理三叉神經(jīng)組織用5mL 經(jīng)L-15培養(yǎng)液稀釋的200U i^一型膠原酶于37°C下消化90分鐘，消化時(shí)每10-15分鐘搖動 一次，使膠原酶能夠充分而均勻地消化組織；（2)向混合物中加入500 μ L的濃度為0. 25% 的胰蛋白酶，37°C水浴中繼續(xù)消化20分鐘，離心后收集消化的組織和細(xì)胞；（3)加入5mL經(jīng) L-15培養(yǎng)液稀釋的胰蛋白酶-EDTA，搖勻后于37°C水浴繼續(xù)消化20分鐘；（4)加入IOmL含 10%胎牛血清的神經(jīng)培養(yǎng)基，中和消化酶，離心得到沉淀細(xì)胞；（5)加入200 μ L含2% B27 的神經(jīng)培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞，再用200 μ m孔徑的細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，用2mL的含2 % Β27神 經(jīng)培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗細(xì)胞篩，獲得細(xì)胞懸浮液。
[0014] 步驟3)所述密度梯度離心為Optipr印密度梯度離心，過程為：將OPTI和Nb+B27 培養(yǎng)液依次按照173:827,124 :876,99:901，74:926的體積比進(jìn)行混合，得到四個(gè)密度梯度 液，按順序依次將其緩慢加至15mL的離心管內(nèi)，然后將2mL細(xì)胞懸浮液緩慢加到密度梯度 液的上面，800g離心15min，棄掉上兩層液體，收集剩余液體。
[0015] 步驟4)所述包被培養(yǎng)裝置是在培養(yǎng)的前一天，向培養(yǎng)裝置內(nèi)加入無菌多聚賴氨 酸溶液，包被30分鐘，吸出多余的多聚賴氨酸，在生物安全柜內(nèi)過夜晾干備用。
[0016] 步驟4)所述懸浮是加入IOmL基礎(chǔ)神經(jīng)培養(yǎng)基，IOOOrpm離心5min，收集細(xì)胞后用 100 μ L神經(jīng)培養(yǎng)液懸?。?br>[0017] 所述培養(yǎng)的條件為37°C、5% CO2及飽和濕度。
[0018] 所述方法具體步驟為：
[0019] 1)取出大鼠的三叉神經(jīng)，置于含L-15培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿上，然后進(jìn)行清洗處理，去 除黏附的其他組織，用眼科剪或手術(shù)刀將其剪碎，獲得預(yù)處理三叉神經(jīng)組織；
[0020] 2)將步驟1)所得預(yù)處理三叉神經(jīng)組織用5mL經(jīng)L-15培養(yǎng)液稀釋后得到的200U 十一型膠原酶在37°C下消化90分鐘，消化時(shí)每10-15分鐘搖動一次，使膠原酶能夠充分而 均勻地消化組織；
[0021] 3)向步驟2)所得混合物中加入500 μ L濃度為0. 25%的胰蛋白酶，37°C水浴中繼 續(xù)消化20分鐘，離心，收集消化的組織和細(xì)胞，倒掉上清液；
[0022] 4)向步驟3)所得組織和細(xì)胞中加入5mL經(jīng)L-15培養(yǎng)液稀釋后得到的胰蛋白 酶-EDTA，搖勻后37°C水浴繼續(xù)消化20分鐘，加入IOmL含10%胎牛血清的神經(jīng)培養(yǎng)基，中 和消化酶，離心得到沉淀細(xì)胞，棄掉上清液；
[0023] 5)向步驟4)所得沉淀細(xì)胞中加入200 μ L含2% B27的神經(jīng)培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞；
[0024] 6)用200 μ m孔徑的細(xì)胞篩過濾步驟5)所得懸液，用2mL的含2 % Β27基礎(chǔ)神經(jīng) 培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞篩，獲得細(xì)胞懸浮液；
[0025] 7)將 OPTI 和 Nb+B27 培養(yǎng)液依次按照 173:827,124:876,99:901，74:926 的體積比 進(jìn)行混合，得到四個(gè)密度梯度液，按順序依次將各梯度液緩慢加至15mL的離心管內(nèi)，然后 將2mL細(xì)胞懸浮液緩慢加到密度梯度液的上面，800g離心15min，棄掉上兩層液體，收集剩 余液體；
[0026] 8)向步驟7)所得液體中加入IOmL基礎(chǔ)神經(jīng)培養(yǎng)基，IOOOrpm離心5min，收集細(xì) 胞，用100 μ L神經(jīng)培養(yǎng)液懸??；
[0027] 9)將步驟8)所得懸浮液均勻地接種到步驟9)所得的已包被的細(xì)胞培養(yǎng)裝置內(nèi)， 在培養(yǎng)箱中用基礎(chǔ)神經(jīng)培養(yǎng)基于37°C，5% CO2，飽和濕度的條件下培養(yǎng)24-48h后獲得三叉 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；
[0028] 所述已包被的細(xì)胞培養(yǎng)基裝置，是在培養(yǎng)的前一天向培養(yǎng)裝置內(nèi)加入無菌多聚賴 氨酸溶液，包被處理30分鐘，洗出多余的多聚賴氨酸，在生物安全柜內(nèi)過夜晾干備用。本發(fā) 明所述方法適用于哺乳動物三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)。本發(fā)明有益效果：
[0029] 1.本發(fā)明優(yōu)化了組織的消化方法，取締了原有的蛋白酶消化過程，采用膠原酶和 胰蛋白酶聯(lián)合消化，其消化過程和消化時(shí)間可使組織消化比較徹底，同時(shí)不使用吹吸的方 式來進(jìn)一步分散細(xì)胞，對細(xì)胞的損傷大大減小。
[0030] 2.本發(fā)明在對組織體外清洗、消化以及分離細(xì)胞的過程中使用了 L-15培養(yǎng)基，能 夠保證沒有CO2平衡調(diào)節(jié)裝置的條件下培養(yǎng)液的穩(wěn)定性，提供了一個(gè)即使無 CO 2平衡調(diào)節(jié)， 也能保證穩(wěn)定、對細(xì)胞或組織損傷很小的液體環(huán)境，穩(wěn)定了滲透壓、PH值等外部培養(yǎng)條件， 大大減小了處理過程中對組織或細(xì)胞的影響。
[0031] 3.現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)多沒有取出雜質(zhì)的過程，本發(fā)明首先對消化后組織進(jìn)行過濾，去 除大塊雜質(zhì)，再利用密度梯度離心的方法富集細(xì)胞，去除了消化過程中產(chǎn)生的大量的細(xì)胞 碎片以及其他細(xì)胞類型等雜質(zhì)的干擾，使培養(yǎng)所得細(xì)胞更純，細(xì)胞培養(yǎng)的成功率更高。
[0032] 4.利用本發(fā)明培養(yǎng)方法可以獲得百萬個(gè)左右較純的三叉神經(jīng)細(xì)胞，提高了細(xì)胞產(chǎn) 量和質(zhì)量，解決了現(xiàn)有技術(shù)的不足，可以滿足藥理學(xué)、電生理學(xué)、發(fā)育、再生以及神經(jīng)毒理學(xué) 等各方面的研宄。
【附圖說明】
[0033] 圖1三叉神經(jīng)細(xì)胞相差顯微鏡圖。
[0034] 圖2三叉神經(jīng)細(xì)胞熒光相差顯微鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0036] 實(shí)施例I :SD大鼠三叉神經(jīng)細(xì)胞分離培養(yǎng)
[0037] 1.包被培養(yǎng)板（皿）
[0038] 在培養(yǎng)的前一天，向要用的培養(yǎng)板（皿）內(nèi)加入適量的（蓋住皿底即可）市售的 無菌的多聚賴氨酸溶液，包被30分鐘左右，吸出多余的多聚賴氨酸，在生物安全柜內(nèi)過夜 晾干，備用。
[0039] 2.分離三叉神經(jīng)組織的細(xì)胞
[0040] 將試驗(yàn)用的150-250g的SD大鼠的雙側(cè)三叉神經(jīng)取出，置于含冷的Hank, s平衡鹽 溶液中，進(jìn)行清洗處理，去除粘附的其他組織，用眼科剪或手術(shù)刀將其剪碎，獲得預(yù)處理三 叉神經(jīng)組織。
[0041] 首先，用含1.5g/L XI-s膠原酶的