一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及雜交瘤細胞株M及其產(chǎn)生的抗納他霉素單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]納他霉素是一種天然、廣譜、高效安全的酵母菌及霉菌等絲狀真菌抑制劑，屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類。它不僅能夠抑制真菌，還能防止真菌毒素的產(chǎn)生?？蓮V泛用于食品防腐保鮮以及抗真菌治療。納他霉素對細菌沒有抑制作用，因此它不影響酸奶、奶酪、生火腿、干香腸的自然成熟過程。1982年6月，美國FDA正式批準納他霉素可以用作食品防腐劑。1996年，中國食品添加劑標準化學(xué)技術(shù)委員會正式批準納他霉素可作為食品防腐劑。
[0003]目前，納他霉素的測定方法主要有生物效價法、微孔板生物檢測法、紫外分光光度計法、元素分析法、比色分析法、薄層色譜法和液相色譜法等。生物效價測定法對實驗環(huán)境因素(溫度等)、材料因素(培養(yǎng)基等)、操作技術(shù)等條件要求高，操作過程也比較繁瑣；微孔板生物檢測法適用于大批量的發(fā)酵液或樣品的檢測；紫外分光光度法一般用來做納他霉素檢測的常規(guī)對照，若將其用于定量分析，對實驗條件要求比較高；元素分析法、比色分析法和薄層色譜法主要用于納他霉素的定性分析；高效液相色譜法(HPLC)多集中于高純度納他霉素產(chǎn)品及食品中納他霉素殘留量的檢測分析，但是這種方法的樣品前處理繁瑣、耗時、儀器貴重、需要專業(yè)人員來操作，不能實現(xiàn)大量樣品的同時檢測。因此建立一種快速、簡單、高通量的納他霉素檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)是一種極為高效、靈敏的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。然而得到高靈敏性和高特異性的單克隆單體是免疫學(xué)檢測的前提。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對納他霉素具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立納他霉素的免疫學(xué)檢測方法。
[0005]本發(fā)明提供一種對納他霉素具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一株納他霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株M,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9802。
[0007]所述雜交瘤細胞株M分泌產(chǎn)生的納他霉素單克隆抗體，它由所述的雜交瘤細胞株M所分泌產(chǎn)生。
[0008]所述的納他霉素單克隆抗體的應(yīng)用，在納他霉素分析檢測中的應(yīng)用。
[0009]納他霉素單克隆抗體，是由保藏號為CGMCCN0.9802的小鼠單克隆抗體雜交瘤細胞株M所分泌。
[0010]本發(fā)明提供的M細胞株的制備，基本步驟為:
(!)免疫原的合成:稱取納他霉素20mg，溶解于3mL DMF中；稱取10mg BSA，溶解于5mL PBS中；將5(^1^質(zhì)量濃度25%戊二醛溶液逐滴加入納他霉素溶液中，避光在室溫下攪拌活化30min ;將活化好的納他霉素逐滴加入BSA中，避光在室溫下攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，用0.0lM PBS透析三天去除未反應(yīng)的納他霉素，得到納他霉素和BSA的偶聯(lián)物，并用紫外進行表征。
[0011]( 2 )小鼠的免疫:納他霉素抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與加強免疫之間間隔一個月，加強免疫之間間隔21天。最后一次用納他霉素(不含佐劑)沖擊免疫，通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；
(3)細胞融合和細胞株的建立:通過聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株M ;
(4)雜交瘤細胞株性質(zhì)的鑒定:通過ELISA法測定靈敏度和特異性。
[0012]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得的抗納他霉素單克隆抗體細胞株，對納他霉素有較好的檢測靈敏度和特異性，ICJt為2.2μ g/L。
[0013]生物材料樣品保藏:一株納他霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株M，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2014年10月15日，保藏編號為CGMCCN0.9802，分類命名為:單克隆細胞株。
【附圖說明】
[0014]圖1.細胞株M單克隆抗體的抑制標準曲線。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0016]本發(fā)明通過將納他霉素抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細胞上清，最終得到了對納他霉素有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0017]實施例1:雜交瘤細胞株M的制備 1、抗原的合成
稱取納他霉素20mg，溶解于3mL DMF中；稱取10mg BSA，溶解于5mL PBS中Jf50yL質(zhì)量濃度25%戊二醛溶液逐滴加入納他霉素溶液中，避光在室溫下攪拌活化30min ;將活化好的納他霉素逐滴加入BSA中，避光在室溫下攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，用0.0lM PBS透析三天去除未反應(yīng)的納他霉素，得到納他霉素和BSA的偶聯(lián)物，并用紫外進行表征。
[0018]2.小鼠免疫
選擇健康的6?8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取納他霉素抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與加強免疫之間間隔一個月，加強免疫之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競爭ELISA方法測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0019]3.細胞融合
在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為4000)方法進行細胞融合，具體步驟如下:(I)無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；(2)收集SP2/0細胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；(3)將脾細胞和SP2/0細胞按照1: 10的比例混合，離心后用50% PEG融合，時間I min，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清，2%的50 XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0020]4、細胞篩選與細胞株建立
在細胞融合的第3天對融合細胞進行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進行用含20%胎牛血清，1%的100 X HT的RPM1-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第7天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步:第一步先用間接ELISA篩選出陽性細胞孔，第二步選用納他霉素為標準品，用間接競爭ELISA對陽性細胞進行抑制效果測定。選擇對納他霉素標準品均有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復(fù)三次，獲得細胞株M。
[0021]5、單克隆抗體的制備與鑒定
取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油ImL ；7天后每只小鼠腹腔注射IX16雜交瘤細胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20°c保存；
使用間接競爭ELISA，測定單克隆抗體納他霉素的IC5tl分別為:2.2 μ g/L，說明對納他霉素有很好的靈敏度，可用于納他霉素免疫分析檢測。
[0022]6.抗體應(yīng)用
將雜交瘤細胞株M通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于納他霉素的ELISA添加回收試驗，具體步驟如下:
(1)包被:將包被原NATA-GA-0VA用0.05M pH 9.6碳酸鹽緩沖液從2Pg/mL開始倍比稀釋，ΙΟΟμ?ν孔，37°C反應(yīng)2h ；
(2)洗滌:將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
(3)封閉:拍干后，加入200μ?7孔封閉液，37°C反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
(4)加樣:將抗血清從1:1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，10PL/孔，37°C反應(yīng)Ih ;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100μ?7孔，37°C反應(yīng)Ih ；
(5)顯色:將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入10PL的TMB顯色液，37°C避光反應(yīng)15min ；
(6)終止和測定:每孔加入50μ?終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標儀測定各孔的OD45tl
值；
(7)結(jié)果判讀:以O(shè)D45tl值大于或等于陰性對照孔的2.1倍(即Ρ/Ν彡2.1)所對應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價。
[0023](8)添加回收及樣品前處理:吸取ImL牛奶于15mL離心管中，向牛奶中分別添加20ng，50ng, 10ng納他霉素，用0.0lM PBS稀釋牛奶20倍，采用間接ELISA進行添加回收試驗，其回收率分別為109%，109%，110%。
[0024]溶液的配置:
碳酸鹽緩沖液(CBS):稱取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至lOOOmL，4°C貯存?zhèn)溆茫?br>磷酸鹽緩沖液(PBS):8.0Og NaCl, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO412 H2O,溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2?7.4，定容至1000 mL ；
PBST:含 0.05% 吐溫 20 的 PBS ；
TMB 顯色液:A液:Na2HP0412H20 18.43g，檸檬酸 9.33g，純水定容至 1000 mL ;B 液:60mgTMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按體積比1: 5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0025]綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明專利申請范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
【主權(quán)項】
1.一株納他霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株M，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9802。
2.權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株M分泌產(chǎn)生的納他霉素單克隆抗體，其特征在于:它由所述的雜交瘤細胞株M所分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的納他霉素單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于在納他霉素分析檢測中的應(yīng)用。
【專利摘要】一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將納他霉素完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后免疫都用不完全弗氏佐劑。將高效價低IC50的小鼠的脾細胞通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過間接競爭ELISA篩選和三次亞克隆，得到一株雜交瘤（單克?。┘毎?。此（單克?。┘毎攴置诘膯慰寺】贵w，對納他霉素具有較好的特異性和檢測靈敏度（IC50值為2.2μg/L），可以用于食品安全中納他霉素的殘留檢測。CGMCC No.980220141015
【IPC分類】C12N5-20, C07K16-44, G01N33-577
【公開號】CN104560886
【申請?zhí)枴緾N201410814893
【發(fā)明人】劉麗強, 陳燕妮, 胥傳來, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 宋珊珊, 吳曉玲
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月25日