一種h9亞型禽流感病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及H9亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感滅活疫 苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avian influenza，Al)是由A型流感病毒引起的一種嚴(yán)重危害禽類健康 的傳染性疾病。禽類感染禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)后，癥狀可表現(xiàn)為非 顯性感染、亞臨診感染，或輕度呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多種形 式。根據(jù)AIV對易感雞致病性的差異，可將AIV分為高致病性AIV和低致病性AIV。
[0003] 1966年Hommee等從美國的Wisconsin北部患有溫和呼吸道疾病的火雞中分離到 了一株AIV-A/Turkey/Wisconsin/1/66,經(jīng)血清學(xué)鑒定為H9亞型，這是H9亞型AIV的第一 個(gè)分離株。之后，H9N2AIV相繼在世界其他地方被發(fā)現(xiàn)，并呈廣泛流行的態(tài)勢，給養(yǎng)禽業(yè)造成 嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。法國的Bennejean在1979年和1980年，從雞體內(nèi)分離到能引起亞臨床 癥狀的禽流感病毒H9N2,1978年和1979年在美國發(fā)病的火雞中分離到H9N2AIV，Alexander 等報(bào)道，2009年Nagarajan等從印度某雞場中也分離到了 H9N2AIV。1994-1999年由H9N2 AIV引起的AI爆發(fā)相繼發(fā)生于世界各地，包括歐洲的愛爾蘭、德國、意大利、亞洲的伊朗、巴 基斯坦、沙特阿拉伯、以色列、韓國、中國以及美國和南非等地。
[0004] H9N2 AIV在我國的流行情況。Shortridge (1992)早在1975年至1985年，就對香 港活禽市場的禽類進(jìn)行了長期的流感監(jiān)測，從外表健康的鴨體內(nèi)分離到了 H9亞型AIVdS 是卻沒有在雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)這個(gè)亞型的AIV。1994年廣東省某雞場蛋雞產(chǎn)蛋下降14%?75%， 肉雞死亡率在10 %?40 %，陳伯倫等從臨床病雞體內(nèi)分離到了 6株病毒，血清學(xué)鑒定為H9 亞型，這是我國內(nèi)地首次分離到H9亞型AIV，將這些病毒實(shí)驗(yàn)室接種雞，表現(xiàn)為典型的臨床 癥狀，但是很快就康復(fù)了，并不致雞死亡。1996年，唐秀英等從四川發(fā)病雞群中分離到1株 H9N2病毒，陳福勇等也從華北地區(qū)分離到H9N2 AIV，并對其核蛋白的基因序列進(jìn)行了克隆 和分析。近年又從我國部分地區(qū)的發(fā)病雞群、鴨群、鵪鶉體中，分離到多株H9N2 AIV，通過對 我國部分省、市、區(qū)商品蛋雞場及養(yǎng)雞專業(yè)村進(jìn)行禽流感血清學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，H9亞型陽性雞 群占總的AIV抗體陽性雞群的93. 67%，其中絕大部分是H9亞型，說明H9亞型AIV在我國 廣泛存在，是我國現(xiàn)有AIV的主要亞型，對我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 由于禽流感病毒變異非?？欤o禽流感防控帶來困難。目前接種疫苗是防控禽流 感的主要手段之一，由于禽流感病毒變異快，流行毒株多，血清學(xué)多且無交叉免疫，其作用 大大受到限制。
[0006] 由此可見，本領(lǐng)域中需要免疫原性更強(qiáng)，交叉保護(hù)性更好的疫苗H9亞型禽流感病 毒毒株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有更強(qiáng)免疫原性和更好交叉保護(hù)性的H9亞型禽流 感病毒，由其制備的H9亞型禽流感滅活疫苗及其制備方法。
[0008] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種H9亞型禽流感病毒，保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏日期為2010年10月22日，保藏編號(hào)為CGMCC No.9813。
[0010] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種H9亞型禽流感滅活疫苗，所述疫苗包括滅活的如 第一方面所述的H9亞型禽流感病毒。
[0011] 在第三方面，本發(fā)明提供了一種H9亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括以下步 驟：
[0012] (a)對包含第一方面所述的H9亞型禽流感病毒的培養(yǎng)液進(jìn)行滅活，以便獲得含有 滅活H9亞型禽流感病毒的溶液；
[0013] (b)向所述含有滅活H9亞型禽流感病毒的溶液加入乳化劑制備水相；以及
[0014] (c)將所述水相與油相進(jìn)行混合乳化，以獲得所述H9亞型禽流感滅活疫苗
[0015] 在本發(fā)明的H9亞型禽流感滅活疫苗的制備方法中，在步驟（a)之前，所述方法還 可以包括將如第一方面所述H9亞型禽流感病毒接種非免疫雞胚中，并在35. 5?37. 5°C，優(yōu) 選的36. 0?37. 0°C，更優(yōu)選的36. 5 °C下進(jìn)行培養(yǎng)，收集所獲得的雞胚尿囊液并通過連續(xù)流 離心收集上清以獲得包含如第一方面所述H9亞型禽流感病毒的培養(yǎng)液，禽流感病毒液血 凝試驗(yàn)HA效價(jià)蘭2 8 (1:256)，并且毒價(jià)ELD5c^ 10 8,可以使用。
[0016] 在本發(fā)明的H9亞型禽流感滅活疫苗的制備方法中，步驟（a)中所述的滅活可以包 括在2°C?8°C，優(yōu)選的4°C -6°C條件下，利用終濃度為1:2000?I :4000，優(yōu)選1:2500? 1 :3500,更優(yōu)選1:3000的丙內(nèi)酯對所述包含H9亞型禽流感病毒的培養(yǎng)液進(jìn)行滅活處理 16?36小時(shí)，優(yōu)選的20-30小時(shí)，更優(yōu)選的25小時(shí)；并在37°C條件下水解2小時(shí)使丙內(nèi)酯 發(fā)生水解，以便獲得含有滅活H9亞型禽流感病毒的溶液。
[0017] 在本發(fā)明的H9亞型禽流感滅活疫苗的制備方法中，步驟（b)中所述的制備水相可 以包括將所述含有滅活H9亞型禽流感病毒的溶液與吐溫-80按照94?97 :3?6的體積 比例進(jìn)行混合，以得到水相；其中，所述吐溫-80的濃度為3. 0%。
[0018] 在本發(fā)明的H9亞型禽流感滅活疫苗的制備方法中，所述油相的制備可以包括將 醫(yī)用級(jí)白油（MARCAL-52,美孚）、司本-80以及硬脂酸鋁按照94 :6 :2的質(zhì)量比進(jìn)行混合，以 得到所述油相。
[0019] 在本發(fā)明的H9亞型禽流感滅活疫苗的制備方法中，步驟（c)中將所述水相與油相 進(jìn)行混合乳化可以包括將所述水相和油相按照體積比為2 :3?2 :4進(jìn)行混合乳化，以獲得 所述H9亞型病疫苗。
[0020] 在第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的H9亞型禽流感病毒在預(yù)防和治療 H9亞型禽流感的藥物的制備中的應(yīng)用。
[0021] 在第五方面，本發(fā)明提供了如第二方面所述的H9亞型禽流感滅活疫苗在預(yù)防和 治療H9亞型禽流感的藥物的制備中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果為：（具體見實(shí)施例4)
[0023] 1、與現(xiàn)有的H9亞型禽流感病毒相比，本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒免疫原性更強(qiáng) 和交叉保護(hù)性更好。具體見實(shí)施例4.
[0024] 2、與現(xiàn)有的H9亞型禽流感病毒疫苗相比，本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒疫苗具有