一種用病毒樣顆粒包被量子點(diǎn)的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種示蹤物質(zhì)的制備方法，確切講本發(fā)明涉及一種用病毒樣顆粒包被量子點(diǎn)的方法，以及用這種方法制備的物質(zhì)及應(yīng)用。【
背景技術(shù)：
】[0002]病毒樣顆粒(Virus-likeParticles,VLPs)，也稱為核心樣顆粒(Core-likeParticles,CLPs)，是由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成的介于15nm?400nm的空心顆粒。VLPs不含病毒基因組，不能自主復(fù)制，在形態(tài)上與真正病毒粒子相似，可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。病毒的衣殼蛋白一般具有天然的自我裝配能力，這為病毒的基礎(chǔ)研宄及疫苗的開發(fā)提供了便利條件。其中一些VLPs允許外源抗原基因的插入或融合，產(chǎn)生在表面展示外源表位的嵌合病毒樣粒子(cVLPs)，或是通過化學(xué)方法將包括非蛋白類抗原在內(nèi)的抗原偶聯(lián)至粒子表面。多數(shù)VLPs具有包裹核酸或其它小分子的能力，可以用作基因或藥物的運(yùn)載工具。至今，已構(gòu)建成功多種人類和動(dòng)物病毒的VLPs。這些病毒粒子包裝形成也各不相同，有的僅需要單一衣殼蛋白、多個(gè)衣殼蛋白，有的還需要病毒脂質(zhì)囊膜。病毒樣粒子具有的獨(dú)特結(jié)構(gòu)、展示表位的能力和能有效刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)為研宄預(yù)防多種疾病提供很好的方法。此外，VLPs也應(yīng)用于研宄病毒包裝過程、形態(tài)以及病毒的體系結(jié)構(gòu)。參見:Rodriguez-Limas,IA.,K.SekarandK.E.Tyo,Virus-likeparticles:thefutureofmicrobialfactoriesandcell-freesystemsasplatformsforvaccinedevelopment.CurrOpinB1technolj2013.24(6):p.1089-93.量子點(diǎn)(quantumdots,簡稱QDs)又可稱為半導(dǎo)體納米微晶體(semiconductornanocrystal),是一種由I1-VI族和II1-V族元素組成的納米顆粒。目前研宄較多的主要是I1-VI型量子點(diǎn)即由第二副族和第六主族元素組成的量子點(diǎn)，如CdS、CdSe、CdTe等。主要應(yīng)用在光學(xué)、生物診斷和傳感器等領(lǐng)域。由于量子點(diǎn)的吸收光譜寬而連續(xù)，而發(fā)射光譜則窄而對(duì)稱，所以可以通過調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的組成和大小達(dá)到光學(xué)性質(zhì)可調(diào)性，同時(shí)光學(xué)穩(wěn)定性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的有機(jī)染料。此外，量子點(diǎn)表面的電子，空穴復(fù)合過程對(duì)許多外部作用非常敏感，據(jù)此可建立熒光傳感系統(tǒng)。如何制備量子產(chǎn)率高、性能穩(wěn)定和具有特殊功能基團(tuán)的量子點(diǎn)一直是研宄者追求的目標(biāo)。目前，量子點(diǎn)的制備主要分為金屬有機(jī)合成和水相合成兩類方法。但是，由于量子點(diǎn)合成方法的限制以及材料自身的缺陷，使其在應(yīng)用領(lǐng)域很受限制，所以如何將量子點(diǎn)合理化修飾成為近期研宄的熱點(diǎn)。為了改善量子點(diǎn)的單分散、水溶性以及發(fā)光穩(wěn)定性，研宄者做了大量的努力。聚合物材料因?yàn)樵陔姶殴庾V的可見光區(qū)對(duì)量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)沒有影響，所以成為量子點(diǎn)修飾的合適試劑。目前關(guān)于聚合物直接修飾量子點(diǎn)表面的研宄主要集中在生物學(xué)和光電子組裝方面，修飾后的量子點(diǎn)穩(wěn)定性大大提高。通常聚合物包覆的量子點(diǎn)比有機(jī)小配體包覆的量子點(diǎn)穩(wěn)定性要強(qiáng)。此外，通過采用聚合物包覆的方法，可以獲得各種各樣功能性的量子點(diǎn)表面。量子點(diǎn)表面直接功能化的成功關(guān)鍵在于量子點(diǎn)在功能化后依然能保持發(fā)光性質(zhì)。參見Luo,Y.H.，etal.，Cadmium-basedquantumdotinducedautophagyformat1nforcellsurvivalviaoxidativestress.ChemResToxicol,2013.26(5):p.662-73.人們已經(jīng)在細(xì)胞成像，免疫分析，DNA雜交，生物傳感器，共振能量轉(zhuǎn)移等方面得到了較為成功的探索與嘗試。在多數(shù)研宄中都涉及了量子點(diǎn)QDs與生物分子偶聯(lián)的問題，這一步往往是進(jìn)行深入研宄的基礎(chǔ)。因此，只有對(duì)生物分子修飾QDs進(jìn)行較為全面的研宄，才能更好地利用這一新型熒光物質(zhì)。目前報(bào)道較多的量子點(diǎn)研宄主要有CdS，ZnS,CdSe,ZnTe、HgSe、CdS、CdTe、InAs、GaAs等。這些量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬、可實(shí)現(xiàn)多種熒光光譜、較大的斯托克斯位移和較好的生物分析等特性.。但這些量子點(diǎn)從應(yīng)用和環(huán)保角度來看，在獲得生物相容性好、無毒性影響，熒光亮度高、穩(wěn)定不變、水溶性好的性能方面還有不少問題有待解決。參見:Woolley,R.,etal.,Fromparticletoplatelet:optimizat1nofastable,highbrightnessfluorescentnanoparticlebasedcelldetect1nplatform.Nanomedicine,2013.9(4):p.540-9.[2]LiF,ZhangZP,PengJ,etal.1magingviralbehav1rinMammaliancellswithself-assembledcapsid-quantum-dothybridparticles[M].2009:718-726.?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0003]本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，具有:生物相容性好、無毒性影響，熒光亮度高、穩(wěn)定不變、水溶性好、用病毒樣顆粒包被的量子點(diǎn)。[0004]本發(fā)明的用病毒樣顆粒包被量子點(diǎn)的方法是用2-巰基乙酸或3-巰基丙酸作為CdSe/ZnS油溶性量子點(diǎn)的表面修飾劑，用犬細(xì)小病毒重組結(jié)構(gòu)蛋白溶液與經(jīng)修飾后的CdSe/ZnS油溶性量子點(diǎn)按體積比5:1_10:1加入透析袋內(nèi)，再在其中按照5%的體積比加入濃度為2mg/mlSUMO蛋白酶，混勻后置pH=6.8的緩沖液透析，通過犬細(xì)小病毒重組結(jié)構(gòu)蛋白的自組裝特性將修飾后的量子點(diǎn)包裝入病毒樣顆粒內(nèi)。[0005]本發(fā)明的用病毒樣顆粒包被量子點(diǎn)的方法中使用的犬細(xì)小病毒重組結(jié)構(gòu)蛋白是犬細(xì)小病毒重組結(jié)構(gòu)蛋白VP2。[0006]本發(fā)明的用病毒樣顆粒包被量子點(diǎn)的方法中，CdSe/ZnS油溶性量子點(diǎn)修飾方法為:將275μI的商品化的CdSe/ZnS正己烷溶液，加入到Iml的無水乙醇中，超聲處理后，離心棄上清后加入300μI氯仿進(jìn)行溶解，然后加入Iml的2-巰基乙酸(MAA)或3-巰基丙酸(MPA)混勻，室溫下劇烈震蕩lh，再經(jīng)離心處理?xiàng)壣锨澹瑢⒊恋碛寐确孪礈?，再用Iml硼酸鹽溶液溶解沉淀。[0007]進(jìn)一步，本發(fā)明的用病毒樣顆粒包被量子點(diǎn)的方法，是將2mg/ml的犬細(xì)小病毒VP2蛋白溶液和修飾后的0.2mg/ml的量子點(diǎn)溶液按體積比5:1加入透析袋內(nèi)，按犬細(xì)小病毒VP2蛋白溶液和修飾后的量子點(diǎn)溶液體積之和的100:1加入SUMO蛋白酶，混勻后放入緩沖液中進(jìn)行酶切包裝，得到目標(biāo)病毒樣顆粒包被量子點(diǎn)。試驗(yàn)中所用的緩沖液有PBS，TBS和HEPES緩沖液，pH值為6.6-7.8，其中:50mM/LTris-HCl,150mM/LNaClpH=6.8最好，可以在包裝效率和生物相容性兩方面達(dá)到最佳效果。[0008]采用前述的方法可以制備出包被量子點(diǎn)的病毒樣顆粒。[0009]本發(fā)明的包被量子點(diǎn)的病毒樣顆粒可在制備示蹤劑方面的應(yīng)用，也可在制備用于研宄病毒入侵機(jī)制的試劑中的應(yīng)用。[0010]采用病毒樣顆粒蛋白作為一種生物運(yùn)載工具，這不僅解決了無機(jī)納米材料量子點(diǎn)在生物應(yīng)用中存在的無機(jī)相容性問題，同時(shí)通過在量子點(diǎn)外部包覆一層病毒衣殼蛋白的形式，來降低量子點(diǎn)的生物毒性作用。犬細(xì)小病毒能夠選擇性的侵染正常細(xì)胞，在侵染細(xì)胞的方式上具有特異性；由犬細(xì)小病毒的VP2蛋白組裝成的VLP，具有與犬細(xì)小病毒相似的特性，VLP-QDs通過犬細(xì)小病毒侵入細(xì)胞的方式，利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)入細(xì)胞，從而提高的QD進(jìn)入細(xì)胞的靶向性。【附圖說明】[0011]圖1.瓊脂糖凝膠電泳圖，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)修飾后表面電性，樣品與甘油按I:I混合均勻加樣，甘油起沉降樣品的作用。其中:MPA-QD是用3-巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)；MAA-QD是用2-巰基乙酸修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)；QD是CdSe/ZnS量子點(diǎn)，VLP是犬細(xì)小病毒樣顆粒。[0012]圖2.Zetasizer檢測(cè)QD修飾前后的表面所帶電荷數(shù)和電性。其中:MPA_QD是用3-巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)；MAA_QD是用2-巰基乙酸修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)。[0013]圖3.TEM透射電鏡圖片，其中㈧為CdSe/ZnS量子點(diǎn)的透射電鏡圖；(B)為MPA-CdSe/ZnS量子點(diǎn)的透射電鏡；(C)為犬細(xì)小病毒樣顆粒的透射電鏡；(D)為犬細(xì)小病毒樣顆粒包被的量子點(diǎn)的(VLP-QD)透射電鏡圖。[0014]圖4.用Nanosizer檢測(cè)不同比例的VP2蛋白與QD包覆后的粒徑大小曲線。[0015]圖5.用紫外連續(xù)光譜檢測(cè)不同比例的VP2蛋白與QD包覆后的吸光率曲線。[0016]圖6.MTT法檢測(cè)MPA-QD和VLP-QD的細(xì)胞毒性曲線。其中:MPA_QD是用3-巰基丙酸修飾的Cd當(dāng)前第1頁1 2