一種液態(tài)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶復(fù)配酶制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種液態(tài)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶復(fù)配酶制劑，屬于酶制劑技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶是存在于微生物（包括細(xì)菌和真菌）的蛋白酶，其活性 中心含有絲氨酸，組氨酸以及天冬氨酸，廣泛用于生物技術(shù)、醫(yī)藥、食品以及釀造等行業(yè)。
[0003] 脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的最適反應(yīng)溫度主要在30°C -50°C之間，脯氨酸特異性 內(nèi)切蛋白酶保藏過程中，前期失活比較嚴(yán)重，當(dāng)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶在30°C時(shí)，其半衰 期為lh，另外保存于37°C的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶7天后就幾乎完全喪失酶活，嚴(yán)重影 響了脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的貯存時(shí)間以及工業(yè)化應(yīng)用。
[0004] 因此，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶酶制劑需要一種有效地復(fù)配方法來提高其貯存穩(wěn) 定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蛋白酶復(fù)配酶制劑，尤其是一種具有良好 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶酶制劑。
[0006] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述復(fù)配酶制劑主要包含脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白 酶、30%-90%的甘油、I-IOmM CaCl2、l-10mM NaClU-IOmM KCl、l-10g/L 山梨醇、0.01-2g/ L山梨酸鉀、2% -10%的聚乙二醇以及0. 5-1. 5g/L明膠；所述百分比是體積百分比。不足 部分以水補(bǔ)足。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶還可替換為其他類似 的酸性蛋白酶。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，復(fù)配酶制劑中脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的含量為 l-10g/L〇
[0009] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述復(fù)配酶制劑含脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶 l-10g/L、30%-60%的甘油、4-6%的PEG400 和l·0-l·5g/L的明膠、8-10g/L的山梨醇、 0· 01-2g/L 的山梨酸鉀，3-5mM 的 CaCl2、3-5mM 的 NaCl 以及 3-5mM 的 KC1。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來源于真菌曲霉 (Aspergillus sp.)或產(chǎn)真菌曲霉脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的工程菌。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶是由野生脯氨酸特異 性內(nèi)切蛋白酶生產(chǎn)菌株或者基因工程菌株發(fā)酵得到。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來源于黑曲霉或者米 曲霉。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來源于產(chǎn)脯氨酸特異 性內(nèi)切蛋白酶的基因工程菌。如發(fā)明名稱為"一種新的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶基因及其 應(yīng)用"，【申請(qǐng)?zhí)枴?01310567472. O的發(fā)明專利申請(qǐng)中記載的基因工程菌；或發(fā)明名稱為"一 種高效表達(dá)米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的基因工程菌及其應(yīng)用"，【申請(qǐng)?zhí)枴?01310568071. 7的發(fā)明 專利申請(qǐng)中記載的基因工程菌。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶是通過微生物發(fā)酵制 備獲得。
[0015] 本發(fā)明提供的蛋白酶復(fù)配酶制劑具有極其優(yōu)異的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，在4°C保存一年，其 酶活保留率仍達(dá)90%以上，在30°C保存15天，其酶活保留率仍達(dá)50%以上，保存30天，其 酶活保留率仍高達(dá)45%以上，解決了由于產(chǎn)品運(yùn)送或儲(chǔ)存時(shí)間較長導(dǎo)致產(chǎn)品應(yīng)用性能迅速 下降的問題。本發(fā)明提供的酶制劑復(fù)配方法簡(jiǎn)單，原料來源豐富并且成本低，特別適合在工 業(yè)上推廣。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶在復(fù)配酶制劑中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。
[0017] 脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活力的測(cè)定方法為：脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶酶 活測(cè)定方法參照 Luppo Edens (Luppo Edens, Peter Dekker, Rob Van Der Hoeven, et al. Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53 (20): 7950-7957)。取適量發(fā)酵濃縮上清 液，加入80 μ I檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液（ρΗ5· 0)和10 μ I 2mmol/L的Z-Gly-Pro-pNA溶 液，搖勻，37°C分別反應(yīng)lOmin。測(cè)定反應(yīng)前后溶液在410nm處的吸光度。在上述條件下，每 分鐘分解Z-Gly-Pro-pNA釋放1 μ mol pN的酶量，定義為一個(gè)酶活單位（U/ml)。通過Λ A41tl 計(jì)算脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶酶活。U/ml= (AA/min)*(V*/rvb);其中ΛΑ/min為吸光 度變化，V為反應(yīng)體系體積（ml)，r為摩爾消光系數(shù)（cm 2/mol)，V為樣品量（ml)，b為比色 杯光程（cm)。上述用量可按比例增加或減少。
[0018] 實(shí)施例1脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的制備
[0019] 脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來源于產(chǎn)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基因工程菌，其構(gòu) 建方法參見發(fā)明名稱為"一種高效表達(dá)米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的基因工程菌及其應(yīng)用"，申請(qǐng) 號(hào)：201310568071. 7的發(fā)明專利申請(qǐng)。
[0020] 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基（3L):
[0021] 搖瓶種子培養(yǎng)基（YPD):酵母浸提物10. 0g/L，蛋白胨20. 0g/L，葡萄糖20. 0g/L。
[0022] 甘油生長相培養(yǎng)基（基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基）：CaS04 0 . 93g/L，85% H3PO4 28.70mL/L， MgS04.7H2014.90g/L，K2S04 1 8 . 20g/L，K0H 4.13g/L。用此培養(yǎng)基配制成含 4% (W/V)的甘 油和4mL/L PTMj^發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0023] 甘油過渡相補(bǔ)料培養(yǎng)基：50% (W/V)甘油，其中PTM1含量為12mL/L。
[0024] 甲醇誘導(dǎo)相培養(yǎng)液：純甲醇誘導(dǎo)液，其中PTM1含量為24mL/L。
[0025] 微量元素 PTM1 溶液：CuSO 4 · 5H20 6. 0g/L，KI 0· 08g/L，MnSO4 · H2O 3. Og/ L，Na2MoO4 · 2H20 0· 2g/L，H3BO3 0· 02g/L，ZnSO4 · 7H20 42. 2g/L，F(xiàn)eSO4. 7H20 65. 0g/L， CoCl2 · 6H20 0· 5g/L，Biotin 0· 2g/L，H2SO4 5. 0mL/L。
[0026] 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件：
[0027] 7L發(fā)酵罐培養(yǎng)，準(zhǔn)確配制2. 5L甘油生長相培養(yǎng)基置于7L發(fā)酵罐內(nèi)，安裝好擋板、 攪拌槳、補(bǔ)料針等，并插入已離線標(biāo)定好的D0、pH和消泡電極，封口保護(hù)電極頭，接上兩個(gè) 空氣過濾器，中間用夾子包扎好，連接好取樣器，然后放置于滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌20min。取 出室溫冷卻，連接上發(fā)酵調(diào)控器，調(diào)節(jié)空氣流量為2. 5L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，菌 體生長溫度為30°C，用氨水自動(dòng)調(diào)控pH值為5. 5。將5瓶種子液并種，并加入10. 875mL過 膜除菌的PTM1溶液，火焰接種，接種量為10%，當(dāng)DO值穩(wěn)定后較100%，在甘油生長相期間 通過蛇管冷卻或加熱套加熱以及自動(dòng)流加氨水控制溫度與pH在設(shè)定值，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速 維持溶氧值在50%以上。發(fā)酵過20-25h，此時(shí)溶氧值會(huì)急劇上升，這表明培養(yǎng)基中的底物 甘油已基本耗盡，維持此狀態(tài)半小時(shí)后開始流加50 %的甘油過渡相培養(yǎng)基，進(jìn)入甘油間歇 補(bǔ)料階段。同時(shí)連接上甲醇控制儀，預(yù)熱。每4h取樣檢測(cè)菌體濃度，當(dāng)其值達(dá)到需要的誘 導(dǎo)菌濃時(shí)，停止補(bǔ)加甘油，維持此狀態(tài)30min，使得甘油徹底耗盡，目的是避免過剩甘油阻遏 啟動(dòng)子A0X1，重新校正溶氧值為100%，同時(shí)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)溫度至28°C。開始進(jìn)入甲醇相，利用 甲醇控制儀變速的向發(fā)酵液中流加甲醇誘導(dǎo)液，起初慢慢增加甲醇補(bǔ)料速率，以免菌體無 法適應(yīng)甲醇而中毒（適應(yīng)期為8h左右），當(dāng)菌體逐漸適應(yīng)了甲醇之后，提高流加速率維持甲 醇濃度在〇.1±〇. 02% (V/V)左右，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，增加流量，混合通純氧的方式維持溶 氧值在10% -20%之間，誘導(dǎo)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的高效表達(dá)。28°C條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 7此后下罐，將發(fā)酵液12000rpm4°C離心20min除去菌體，得到上清液，抽濾過0· 22 μ m的水 相濾膜除菌，即為含脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的水溶液。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 復(fù)配液體酶制劑各組分的含量如下：
[0030] 脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶l-10g/L
[0031] 甘油 20%-30% (v/v)
[0032] PEG400 5-10% (v/v)
[0033] 明膠 1.0-1. 5g/L
[0034] 山梨醇 8-10g/L
[0035] 山梨酸鉀 0.05-lg/L
[0036] CaCl2 3_5mM
[0037] NaCl l_3mM
[0038] KCl l-3mM
[0039] 調(diào)復(fù)配酶制劑pH在3· 0-5. 0。
[0040] 復(fù)配后的液體酶制劑放置于4°C保存15天以