快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA 的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子克隆技術(shù)，具體地，涉及一種快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)是一種從RNA擴(kuò)增cDNA拷貝的方法。在RT-PCR中首要的步 驟為酶促催化使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，一條寡聚核苷酸引物先與mRNA雜交，然后由 RNA聚合酶催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的cDNA拷貝，后者能進(jìn)一步用于PCR擴(kuò)增。目前所用的引物 中可以分為特殊靶基因序列設(shè)計的引物、隨機(jī)引物和oligo(dT)引物。
[0003] Oligo (dT)引物能與哺乳動物mRNA的內(nèi)源poly (A) +尾相結(jié)合，作為一種通用引物 能用于常規(guī)的第一鏈cDNA的合成，這種引物合成出的第一鏈cDNA具有cDNA完整的3 '末 端poly (A) +尾，但是由于逆轉(zhuǎn)錄酶的擴(kuò)增效率有限，擴(kuò)增出的cDNA片段多半并非全長cDNA 序列，特別是對于較長的cDNA片段很可能不能擴(kuò)增至完整的5 '末端，這時如果在后續(xù)步 驟中利用cDNA完整的5'末端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增就很可能擴(kuò)增失敗。隨機(jī)六核苷酸引物是 能夠沿著RNA模板的許多位點(diǎn)引導(dǎo)cDNA合成，并產(chǎn)生RNA分子總體中的許多片段的拷貝。 尤其在靶RNA序列很長或包含很多二級結(jié)構(gòu)使之用oligo(dT)或合成的寡核苷酸引物不能 有效引導(dǎo)cDNA合成時，應(yīng)用隨機(jī)六核苷酸引物是非常有用的，這種引物對mRNA的種群無限 制，所有種群都能作為PCR模板，而且在擴(kuò)增時具有非常大的隨機(jī)性，可能擴(kuò)增出較長的帶 有完整5 '末端的cDNA片段。
[0004] 大多數(shù)常用質(zhì)粒都含有可被不同內(nèi)切酶識別的多克隆位點(diǎn)。由于可供選擇的克隆 位點(diǎn)很多，因此一般來說總是能夠找到一個帶有與某一特定外源DNA片段末端相匹配的酶 切位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。在無法找到在質(zhì)粒載體與目的DNA之間符合定向克隆的酶切位點(diǎn)時也 可通過設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的引物的方法在目的DNA兩段引入特定的酶切位點(diǎn)然后進(jìn)行定 向克隆。（分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，科學(xué)出版社，2002年8月第 三版，68-69)
[0005] 不同的引物有各自的特性，擴(kuò)增出的cDNA片段多半不能同時包含全長cDNA的 3 '末端和5 '末端。如果需要擴(kuò)增出完整的cDNA片段，單用一種引物逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA模 板，很可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。DNA聚合酶的擴(kuò)增效率有限，而且擴(kuò)增片段越長，錯配的可能越 大。直接擴(kuò)增出全長的cDNA片段費(fèi)時費(fèi)力。
[0006] 大鼠5-脂肪氧合酶（5-L0)的mRNA編碼區(qū)含2, 025個堿基，目前人和小鼠的5-L0 基因序列已完全清楚，但大鼠的5-L0序列并不完全明確，為了獲取大鼠5-LOcDNA序列，發(fā) 明人查閱了 NCBI和Ensembl網(wǎng)站上所提供的大鼠5-L0 cDNA序列，發(fā)現(xiàn)兩者并不完全相同， 它們編碼的蛋白有12個氨基酸不相同，其中包括NCBI的序列（NM_012822. 1)編碼蛋白所 缺失的4個氨基酸。5-L0 mRNA主要存在于各種白細(xì)胞中，在其他組織的表達(dá)量普遍偏低。 5-L0 cDNA編碼區(qū)長達(dá)2kb以上，無論用何種逆轉(zhuǎn)錄引物和逆轉(zhuǎn)錄酶都很難逆轉(zhuǎn)錄出全長 的5-L0編碼區(qū)cDNA，而且逆轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA 5'端區(qū)常常是不完整的。
[0007] 為了獲得大鼠 5-LO編碼區(qū)cDNA以便將來用于5-LO的表達(dá)，需要克隆出正確的大 鼠 5-LO編碼區(qū)cDNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種克隆長片段CDNA的方法。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的在于提供快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA (5-LO cDNA)的 方法。
[0010] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對于較長片段的cDNA，直接獲取全長cDNA存在困難的情況下可以在 cDNA片段中間部位選擇一個酶切位點(diǎn)作為分段克隆的位點(diǎn)，分別設(shè)計引物分段從cDNA模 板中擴(kuò)增出兩個片段，然后利用質(zhì)粒載體通過定向克隆的方法將兩個片段連接從而得到完 整的全長cDNA片段。
[0011] 本發(fā)明首先提供一種克隆長片段CDNA的方法，包括以下步驟：
[0012] (1)提取mRNA，分別用oligo(dT)和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄mRNA，將兩種cDNA產(chǎn)物混合；
[0013] (2)在目的cDNA片段中間位置上選擇酶切位點(diǎn)作為分段擴(kuò)增的位點(diǎn)，在此位點(diǎn)前 后選取序列設(shè)計2對引物；
[0014] (3)分別用步驟⑵中的兩種引物對步驟⑴獲得的混合cDNA進(jìn)行分段擴(kuò)增，選 擇不含步驟（2)中用于分段擴(kuò)增酶切位點(diǎn)的T載體，用T-A連接的方法將兩個片段分別克 隆入T載體，再使用特定的限制性內(nèi)切酶酶切兩種載體，通過定向克隆的方法將兩個片段 連接。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種快速克隆大鼠 5-脂肪氧合酶cDNA的方法，包括以下步驟：
[0016] (1)提取大鼠 mRNA，分別用oligo(dT)和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄mRNA，將兩種cDNA產(chǎn)物 混合；
[0017] (2)在目的cDNA片段中間位置上選擇一個酶切位點(diǎn)作為分段擴(kuò)增的位點(diǎn)，在此位 點(diǎn)前后選取序列設(shè)計2對引物；
[0018] (3)分別用步驟⑵中的兩對引物對步驟（1)獲得的混合cDNA進(jìn)行分段PCR擴(kuò) 增，選擇不含分段擴(kuò)增酶切位點(diǎn)的克隆載體，用T-A連接的方法將兩個片段分別克隆入載 體，然后使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切；通過定向克隆的方法將兩個片段連接。
[0019] 其中，步驟（1)中大鼠 mRNA來自胎鼠肝臟。
[0020] 步驟（1)中的 oligo(dT)為：oligo(dT)15 ?17。
[0021] 本發(fā)明的快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的方法中，步驟（2)的酶切位點(diǎn)為Pml Io
[0022] 進(jìn)一步地，步驟（2)的2對引物序列分別如SEQ ID NO. 1-4所示。
[0023] 步驟（3)兩對引物分段擴(kuò)增5-L0 cDNA示意圖見圖1。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟（3)的PCR擴(kuò)增方法為：94°C 30秒，57°C 30秒，72°C 2分鐘，共30 個循環(huán)。
[0025] 其中，步驟（3)所述的克隆載體為pBluescript II SK(+)。
[0026] 步驟（3)所述的定向克隆的方法是將插入方向?yàn)镋c0RI-XhoI的第一段克隆和第 二段克隆質(zhì)粒，分別用XhoI和PmlI酶切，瓊脂糖凝膠分離；切膠回收含有第一段cDNA克隆 的T載體（4. 3kb)和第二段cDNA克隆的條帶（0. 7kb)。
[0027] 用玻璃奶純化含有第一段cDNA克隆的T載體和第二段cDNA克隆的條帶后，在 T4DNA連接酶反應(yīng)下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后經(jīng)EcoRI和XhoI酶切 鑒定和測序，選取正確連接的克隆，即可得到全長的5-LOcDNA。
[0028] 在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，記載了如下快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的方 法①首先從胎鼠肝臟中提取大鼠總mRNA，分別通過oligodT和隨機(jī)引物分別逆轉(zhuǎn)錄成 總cDNA，然后將兩種cDNA模板混合，組成模板庫備用，②選擇大鼠5-LOcDNA片段中的一 個單一酶切位點(diǎn)，位點(diǎn)應(yīng)該在靠 cDNA中間位置，在這一位點(diǎn)前后設(shè)計引物，利用混合的 cDNA模板庫進(jìn)行擴(kuò)增，③分段擴(kuò)增的cDNA片段兩3'端加"A"后連接入藍(lán)白篩選T載體 pBluescript II SK(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF'，提取質(zhì)粒后測序，選取正確插入方向的 兩個質(zhì)粒：含有第一段5-L0cDNA序列的pBluescript-lD和含有第二段5-L0cDNA序列的 pBluescript_2D大量擴(kuò)增；④用pBluescript II SK(+)上的酶切位點(diǎn)和5-LOcDNA片段上 的酶切位點(diǎn)共同酶切其中一個提取的質(zhì)粒，得到的片段連接入另一個酶切的質(zhì)粒中，即可 得到全長的5-LOcDNA。
[0029] 本發(fā)明從大鼠胚胎肝臟總RNA中再純化出mRNA，用mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA作為PCR 模板顯著提高了擴(kuò)增效率。用oligodT和隨機(jī)引物分別逆轉(zhuǎn)錄后將cDNA模板混合，制作模 板庫，提高了長片段cDNA 5'末端擴(kuò)增出來的幾率，可以得到既含有3'末端，又含有5'末 端的cDNA片段；本發(fā)明在一開始就選擇了酶切位點(diǎn)，但是分段擴(kuò)增后克隆入載體的時候沒 有用這些酶切位點(diǎn)，用了 T-A連接，因?yàn)?-LO cDNA的表達(dá)量很低，逆轉(zhuǎn)錄成第一條cDNA鏈 后模板量很少，而帶有酶切位點(diǎn)的引物與模板結(jié)合時，結(jié)合率不如全匹配引物，會降低PCR 擴(kuò)增效率，本發(fā)明使用全匹配引物擴(kuò)增后用T-A連接，連接完了再通過測序選擇正確的克 隆大量擴(kuò)增，在把兩段cDNA相連的時候才用到了這兩個酶切位點(diǎn)進(jìn)行定向克隆，這個方法 更方便快速，效率更高。
[0030] 另外，本發(fā)明采用分段擴(kuò)增再連接的方法避免了目前DNA聚合酶可能存在的長片 段擴(kuò)增效率低下和錯配的幾率。本發(fā)明可以快速克隆得到全長5-LO cDNA編碼區(qū)目的片段 cDNA序列，避免了不能得到完整的cDNA兩端（指3'端和5'端）序列從而使克隆失敗的情 況，克服了 mRNA表達(dá)量低時難以獲得cDNA的情況，并大大降低了直接逆轉(zhuǎn)錄獲得全長cDNA 編碼序列的操作難度。
【附圖說明】
[0031] 圖1為5-LO cDNA分段擴(kuò)增示意圖，其中ID引物是指擴(kuò)增5-LO cDNA第一段擴(kuò)增 片段的引物對，2D引物是指擴(kuò)增5-LO cDNA第二段擴(kuò)增片段的引物對。
[0032] 圖 2 為第一段、第二段 5-LO cDNA 片段插入 pBluescript II SK(+)載體，DNA 測 序選擇正確插入方向的載體構(gòu)建示意圖。其中pBluescript II SK(+)載體為經(jīng)EcoRV酶 切后產(chǎn)生平端，在3'端加 T制得的T載體。
[0033] 圖 3 為 5-LO cDNA 分段擴(kuò)增 PCR 結(jié)果圖，其中 I : 2kb DNA Ladder ; 2:5-LO cDNA 第 一段擴(kuò)增片段1339bp ;3:5-L0 cDNA第二段擴(kuò)增片段790bp。
[0034] 圖4為5-LO cDNA編碼區(qū)的第一段和第二段的重組質(zhì)粒用EcoRI和XhoI酶切鑒 定。I :2kb DNA Ladder ;2:pBlu