來(lái)源于大豆的根特異性啟動(dòng)子GmPRP2p-369及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種來(lái)源于大豆的根特異性啟動(dòng)子GmPRP2p-369及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動(dòng)子是基因的組成部分，控制基因表達(dá)的起始和表達(dá)程度。在轉(zhuǎn)基因育種中，夕卜 源基因在植物體中的精確調(diào)控主要是通過(guò)合適的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)的。目前，在基因工程中廣泛 使用的是組成型啟動(dòng)子，但是由于組成型啟動(dòng)子驅(qū)使目的基因在植物組織中的表達(dá)是恒定 和持續(xù)的，不受時(shí)空和外界因素的限制，會(huì)過(guò)度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，產(chǎn)生大量異源蛋 白質(zhì)或代謝產(chǎn)物，破壞了植物原有的生理代謝平衡，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)異常甚至死亡。與組成型 啟動(dòng)子相比，根特異性啟動(dòng)子它所驅(qū)動(dòng)的外源基因在受體植物根中表達(dá)，克服了組成型啟 動(dòng)子由于持續(xù)、高效的啟動(dòng)外源基因非特異性表達(dá)而造成的細(xì)胞物質(zhì)的過(guò)度消耗。隨著轉(zhuǎn) 基因植物安全標(biāo)準(zhǔn)的提高，包括所有商業(yè)化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在內(nèi)，要求必須對(duì)所用啟動(dòng)子的 表達(dá)活性、潛在重組能力、對(duì)周邊環(huán)境以及安全性影響進(jìn)行詳細(xì)的研究。
[0003] 大豆是一種重要的糧油飼兼用作物，在我國(guó)大豆產(chǎn)區(qū)大多處于干旱、鹽堿及高寒 等區(qū)域，應(yīng)用的大豆品種耐逆性不強(qiáng)，嚴(yán)重的旱澇病蟲(chóng)害等非生物和生物逆境脅迫顯著影 響大豆產(chǎn)量。目前在轉(zhuǎn)基因大豆中使用的都是CaMV35S啟動(dòng)子，根特異啟動(dòng)子應(yīng)用到大豆 轉(zhuǎn)基因中，為大豆轉(zhuǎn)基因研究提供更加豐富的啟動(dòng)子元件，同時(shí)也為培育耐旱、耐鹽、耐冷 等轉(zhuǎn)基因大豆新品種提供一種手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
[0005] 本發(fā)明所提供的具有啟動(dòng)子功能的DNA分子，來(lái)源于豆科大豆屬栽培大豆 (Glycine max (L. ) Merr. ) Williams82,是下述 a) -c)中任一 DNA 片段：
[0006] a)至少含有序列表中序列2的第694-1062位核苷酸序列，并且從序列2的第694 位開(kāi)始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為369至852bp的任意一 個(gè)DNA片段；
[0007] b)與a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段；
[0008] c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片 段。
[0009] 上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 I X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0010] 在本發(fā)明中，所述具有啟動(dòng)子功能的DNA分子為序列表中序列2的第694-1062位 核苷酸所示的DNA分子，命名為GmPRP2p-369。
[0011] 其中，序列表中序列2由1062個(gè)核苷酸組成，為序列1的第1-1062位。
[0012] 含有所述DNA分子(啟動(dòng)子)的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 在本發(fā)明中，所述重組載體為在pC13Pl載體的多克隆位點(diǎn)（如Sac I和Xba I )插 入含有所述DNA分子的DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。
[0014] 進(jìn)一步，所述重組載體按照如下方法獲得：將所述DNA分子與pEASY-Tl載體相連， 得到中間載體；用限制性內(nèi)切酶Sac I和Xba I雙酶切所述中間載體，將還有所述DNA分子 的酶切片段與同樣經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶Sac I和Xba I雙酶切的所述pC13Pl載體的骨架片 段相連，得到所述重組載體。
[0015] 所述pC13Pl載體是以pCAMBIA1301載體為基礎(chǔ)改造得到的環(huán)形載體，所述pC13Pl 載體上不含有任何啟動(dòng)子的序列，用來(lái)滿足研究啟動(dòng)子功能的需要。
[0016] 具體而言,所述PC13P1載體的序列如序列表中序列3所示。
[0017] 所述表達(dá)盒可以由具有啟動(dòng)子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動(dòng)表達(dá)的 目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所 述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的基因具體為⑶S基因（來(lái)源于所述pC13Pl載 體）；所述轉(zhuǎn)錄終止序列具體為NOS轉(zhuǎn)錄終止子(來(lái)源于所述pC13Pl載體)。
[0019] 所述DNA分子在植物中啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 在所述應(yīng)用中，所述表達(dá)為根特異性表達(dá)。
[0021] 進(jìn)一步，所述根特異性表達(dá)可為根中高表達(dá)，具體為根中的表達(dá)量顯著高于其他 組織(如葉柄、葉片主脈、花、果莢外殼)。在其他組織中只存在微量的表達(dá)。
[0022] 在所述應(yīng)用中，所述目的基因可為GUS基因。所述植物可為雙子葉植物或單子葉 植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥或大豆。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物具體為擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh. ) Columbia。
[0024] 另外，擴(kuò)增所述DNA分子(啟動(dòng)子）的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025] 在本發(fā)明中，擴(kuò)增所述DNA分子(啟動(dòng)子）的引物對(duì)為如下：
[0026] 5'-TCCCATGCCATAATGCG-3' ；
[0027] 5'-GGTTTCTCACGTTGTAGTTG-3' 。
[0028] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的GmPRP2p_369啟動(dòng)子，能夠有效啟動(dòng)目的基因在根中 的特異性表達(dá)。本發(fā)明為植物在根部的分子改良提供了一種手段，對(duì)植株的抗逆研究就有 一定意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為第一輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。箭頭所示為目的條帶。
[0030] 圖2為第二輪PCR產(chǎn)物GmPRP2p-1062的瓊脂糖凝膠電泳圖。箭頭所示為目的條 帶。
[0031] 圖3為GmPRP2p-852和GmPRP2p-369啟動(dòng)子的PCR檢測(cè)結(jié)果。其中，泳道M為 DL5000的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1、2分別為GmPRP2p-852、GmPRP2p-369的PCR產(chǎn)物。
[0032] 圖 4 為重組質(zhì)粒 pEASY-GmPRP2p-852、pEASY-GmPRP2p-369 和 pC13Pl 載體的 Sac I 和Xba I雙酶切電泳圖。其中，泳道M為DL2000的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1、2、3分別為 pEASY-GmPRP2p-852、pEASY-GmPRP2p-369 和 pPC13Pl。
[0033] 圖5為pC13Pl載體的質(zhì)粒圖譜。
[0034] 圖6為pC13 (Delta)⑶S載體的質(zhì)粒圖譜。
[0035] 圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl代的分子檢測(cè)結(jié)果。其中，A、B分別代表轉(zhuǎn) pCAM-PRP2p-852、pCAM-PRP2p-369 擬南芥植株檢測(cè)結(jié)果。A 和 B 中，泳道 M 為 DL2000plus 的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道CK+為陽(yáng)性對(duì)照；泳道CK-為陰性對(duì)照；其他泳道分別為不同轉(zhuǎn)基 因株系，有目的條帶(箭頭所示位置）出現(xiàn)的為陽(yáng)性。
[0036] 圖8為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段不同發(fā)育時(shí)期⑶S染色結(jié)果。
[0037] 圖9為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代的生殖生長(zhǎng)階段不同發(fā)育時(shí)期⑶S染色結(jié)果。
[0038] 圖10為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代的植株根和葉中的GUS活性定量測(cè)定結(jié)果。其 中，WT表示未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥Columbia ;P852-5、P852-9、P852-30是三株鑒定 陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAM-PRP2p-852擬南芥植株；P369-2、P369-3、P369-6是三株鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn) pCAM-PRP2p-369擬南芥植株。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的 引物合成及測(cè)序工作均由華大公司完成。
[0042] 栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82 :記載于"許碩·野生大豆鹽脅迫 相關(guān)microRNA的功能分析.2011年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文"一文，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作 物科學(xué)研究所供給。
[0043] pC13Pl載體和pC13 (Delta)⑶S載體：均為環(huán)形載體，由中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè) 生態(tài)研究所Pedro S. C. F. Rocha研究員提供。pC13Pl載體上不含有任何啟動(dòng)子，但含有⑶S 報(bào)告基因(如圖5) ;pC13 (Delta)⑶S載體不含有⑶S基因，但含有卡那霉素抗性和潮霉素 抗性(如圖6)。所述pC13Pl載體的序列為序列表中序列3所示；所述pC13 (Delta)⑶S載 體的序列為序列表中序列4所示。
[0044] 擬南芥（Arabidopsis thaliana(L. )Heynh. ) Columbia :記載于"郭曉 麗.Columbia型擬南芥愈傷組織培養(yǎng)研究.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009年01期"一文，由中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所供給。
[0045] 根癌農(nóng)桿菌GV3101 :記載于"趙湛，李文生.不同根癌農(nóng)桿菌菌株類型對(duì)木霉菌 遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響.北方園藝，2006年03期" 一文，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 供給。
[0046] 實(shí)施例1、GmPRP2p全長(zhǎng)啟動(dòng)子的克隆及序列測(cè)定