7、檢測出目的條帶的株系，其T2代種子采用步驟6中同樣的方法種植培養(yǎng)，收獲 T3種子，選擇T3代不再分離的純合株系的種子用來后續(xù)的試驗(yàn)。
[0084] 二、轉(zhuǎn)GmTIPp-1546、GmTIPp-1201擬南芥表達(dá)特性的研究
[0085] 1、營養(yǎng)生長階段不同發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)特性
[0086] 取生長ld、3d、7d、20d的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行⑶S組織染色。同時(shí)以未轉(zhuǎn) 基因的野生型擬南芥Columbia和轉(zhuǎn)入pC13Pl空載體的擬南芥植株作為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三 次。
[0087] ⑶S組織化學(xué)染色參照J(rèn)efferson的方法。具體如下：將待染色的組織樣品放入 檢測液中，37°C溫育12-16h。70%，90%乙醇分別浸泡2h后，70%乙醇過夜，以除去綠色組織 中的葉綠素。顯微鏡下或用肉眼觀察供試樣品的染色結(jié)果，并照相。白色背景下的藍(lán)色即 為⑶S表達(dá)位點(diǎn)。其中，檢測液配方如下 ：50mmol噸4磷酸緩沖液(配方：4.095g似2即04和 2. 537g NaH2PO4 定容到 IL 水溶液中），ρΗ7· 0, IOmmol .L-1EDTAjO. 1% (w/v) Triton X-100， 2mmol · I71鐵氰化鉀，2mmol · I71亞鐵氰化鉀，5% (w/v)X-Gluc。各濃度為相應(yīng)組分在檢 測液中的終濃度。
[0088] 結(jié)果如圖8所示，從圖中可以看出，在所有轉(zhuǎn)GmTIPp-1546和GmTIPp-1201擬南芥 植株中，從種子萌發(fā)開始，在其不同生長時(shí)期，在根和下胚軸中檢測到GUS基因的表達(dá)活性 (藍(lán)色)，在其轉(zhuǎn)基因植株葉片中幾乎沒有檢測到。而作為對照的未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥 Columbia和轉(zhuǎn)入pC13Pl空載體的擬南芥植株均無⑶S表達(dá)。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
[0089] 2、生殖生長階段的組織表達(dá)特性
[0090] 將生長2周的T3轉(zhuǎn)基因擬南芥植株從培養(yǎng)基中移栽到土壤基質(zhì)中繼續(xù)生長，在開 花結(jié)莢期對其各組織器官（葉、花、果）進(jìn)行GUS組織染色，方法同步驟1。同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因 的野生型擬南芥Columbia和轉(zhuǎn)入pC13Pl空載體的擬南芥植株作為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0091] 結(jié)果如圖9所示，在生殖生長時(shí)期，轉(zhuǎn)GmTIPp-1546和GmTIPp-1201擬南芥植株 中，在其葉、花、果中均幾乎沒有檢測到GUS表達(dá)活性。而作為對照的未轉(zhuǎn)基因的野生型擬 南芥Columbia和轉(zhuǎn)入pC13Pl空載體的擬南芥植株均無⑶S表達(dá)。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
[0092] 3、⑶S活性的測定
[0093] 分別取生長20d的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的根和葉，每個(gè)轉(zhuǎn)基因植株取3個(gè)株系，測定 根和葉中的⑶S活性。同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥Columbia(記為WT)和轉(zhuǎn)入pC13Pl 空載體的擬南芥植株作為對照。具體如下：
[0094] (1) 4-甲基傘形酮（4-MU)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0095] 4-甲基傘形酮（4-MU)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：用0. 2M Na2CO3水溶液分別配制不同 濃度的 4-MU 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，lmM4-MU、10 μ M4-MU、1 μ M4-MU、100nM4-MU、50nM4-MU、10nM4-MU、 5nM4-MU。其中，4-MU標(biāo)準(zhǔn)品為sigma公司產(chǎn)品，目錄號為M1381。測定在激發(fā)光365nm，發(fā) 射光455nm下的熒光光度值。根據(jù)4-MU標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)熒光光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0096] (2)待測樣品的制備
[0097] 將取好的根和葉分別放入研缽中（預(yù)冷)，用Iml的GUS提取液研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入 1. 5ml的離心管中，ISOOOrpnufC，離心IOmin,收集上清液，得到待測樣品，用于檢測。
[0098] 其中，⑶S提取液配方如下：50mM磷酸緩沖液(配方：4. 095g Na2HPO4和 2. 537gNaH2P04 定容到 IL 水溶液中），ρΗ7· 0, IOmM Na2-EDTA，pH8. 0, ΙΟπιΜβ -巰基乙醇，0· 1% (w/v) Triton Χ-100。各濃度為相應(yīng)組分在⑶S提取液中的終濃度。
[0099] (3)⑶S活性測定
[0100] A.⑶S反應(yīng)
[0101] GUS 反應(yīng)液：4. 08g4_ 甲基傘形酮-β -D-葡萄糖醒酸苷（4-MethylumbelIifery-β -D-Glucuronide簡稱4-MUG)定容到IOml⑶S提取液中，用來進(jìn)行酶促反應(yīng)。其中，4-MUG 為INALCO公司產(chǎn)品，目錄號為1758-1630。
[0102] ⑶S終止反應(yīng)液：0. 2M Na2CO3水溶液，用來終止反應(yīng)。
[0103] 反應(yīng)過程：將90μ 1的⑶S反應(yīng)液加入I. 5ml的離心管中，37°C預(yù)熱，加入10μ 1 上述步驟（1)中提取好的上清液，37°C反應(yīng)60min后，加入900μ 1的⑶S終止反應(yīng)液。同 時(shí)，每一個(gè)樣品有Omin反應(yīng)的對照，測定365nm/455nm熒光光度值。根據(jù)所測熒光光度值 及步驟（1)得到的4-甲基傘形酮（4-MU)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到的"單位時(shí)間的4-MU濃度變 化"。
[0104] B.蛋白含量測定
[0105] 取上述待測樣品（提取好的上清液）10 μ 1，加入200 μ 1考馬斯亮藍(lán)，室溫反應(yīng) 15min，在酶標(biāo)儀上測定595nm的吸光值。
[0106] 牛血清蛋白（BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液（lmg/ml)由Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒提供 (TIANGEN，目錄號 PA102)。分別取 0、0· 5、1· 5、2· 5、3· 5、4· 5、5· 5、6· 5μ I BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，每 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣用〇. 15Μ NaCl水溶液定容到10 μ 1，加入200 μ 1考馬斯亮藍(lán)，室溫反應(yīng)15min，在 酶標(biāo)儀上測定595nm的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度換算上述待測樣品(提取好的上清液） 中的蛋白含量。
[0107] C.⑶S活性計(jì)算
[0108] 根據(jù)A和B的檢測結(jié)果，計(jì)算待測樣品的⑶S活性，用"nmol/min/mg蛋白"表示。 具體而言，用"單位時(shí)間的4-MU濃度變化"除以"待測樣品中的蛋白含量"，求出單位質(zhì)量的 蛋白單位時(shí)間的4-MU濃度變化，即為單位時(shí)間內(nèi)的GUS活性。
[0109] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0110] 結(jié)果如圖10,在所有轉(zhuǎn)GmTIPp-1546和GmTIPp-1201擬南芥植株中，在根中的⑶S 表達(dá)活性均顯著高于葉中，并且在各轉(zhuǎn)基因植株根中都有較強(qiáng)的表達(dá)活性。而作為對照的 未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥Columbia (WT)和轉(zhuǎn)入pC13Pl空載體的擬南芥植株的根和葉中 均無⑶S表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. DNA分子，是下述a)-C)中任一的DNA片段： a) 至少含有序列表中序列2的第854-2054位核苷酸序列，并且從序列2的第854位開 始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5'端延長，得到長度為1201至1546bp的任意一個(gè) DNA片段； b) 與a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段； c) 在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子為序列表中序列2的 第854-2054位核苷酸所示的DNA分子。
3. 含有權(quán)利要求1或2所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體為在pC13Pl載體的多 克隆位點(diǎn)處插入權(quán)利要求1或2所述DNA分子后得到的重組質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其特征在于：所述表達(dá)盒由具有啟動子功能的所述 DNA分子，由所述DNA分子啟動表達(dá)的目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述DNA分子以 功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。
6. 權(quán)利要求1或2所述DNA分子在植物中啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述表達(dá)為根特異性表達(dá)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為雙子葉植物或單子葉植 物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述雙子葉植物為擬南芥或大豆。
10. 擴(kuò)增權(quán)利要求1或2所述DNA分子的引物對。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于大豆的根特異性啟動子GmTIPp-1201及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的啟動子為如下中的至少一種：a）至少含有序列表中序列2的第854-2054位核苷酸序列，并且從序列2的第854位開始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5′端延長，得到長度為1201至1546bp的任意一個(gè)DNA片段；b）與a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；c）在嚴(yán)格條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。本發(fā)明所提供的啟動子能夠有效啟動目的基因在根中的特異性表達(dá)。本發(fā)明為植物在根部的分子改良提供了一種手段，對植株的抗逆研究就有一定意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-113, C12N15-84, C12N1-21, C12N15-11
【公開號】CN104560990
【申請?zhí)枴緾N201310467083
【發(fā)明人】韓天富, 陳莉, 蔣炳軍, 孫 石, 侯文勝, 吳存祥
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月9日