家蠶受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白BmREEPa基因及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及家蠶受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白BmREEPa基因，還涉及還 有該基因的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目昆蟲。BmNPV是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見且危害最嚴(yán) 重的一類病原，對蠶業(yè)影響巨大。如何利用當(dāng)今發(fā)展迅速的基因工程技術(shù)，從根本上提高家 蠶病毒抗性，是蠶業(yè)領(lǐng)域重要的研宄課題。近些年對宿主抗性基因的研宄表明，干涉或過表 達(dá)某些宿主的基因可以影響B(tài)mNPV對宿主的感染。因此，干涉或過表達(dá)這些宿主基因?qū)⒊?為防治家蠶感染BmNPV的一種有效策略。
[0003] 基因 RNA 干擾（RNA interference，RNAi)是指外源性雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)引發(fā)生物體內(nèi)同源mRNA降解從而表現(xiàn)出的基因轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象，現(xiàn)已成為分 子生物學(xué)家分析基因組功能和基因治療的一個(gè)有力工具。小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)是RNAi的效應(yīng)分子，是一類長21?23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，在體內(nèi)可特異性降 解與其序列互補(bǔ)的mRNA而引發(fā)RNA沉默。產(chǎn)生siRNA的方法有多種，其中化學(xué)合成法簡單 易行，但由于siRNA的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)易被核酸酶降解，RNAi干擾效應(yīng)時(shí)間短，因而分 子生物學(xué)家多采用siRNA表達(dá)載體法，即將短發(fā)卡RNA (short hairpin RNA，shRNA)對應(yīng)的 DNA模板序列插入載體啟動(dòng)子后構(gòu)建RNAi載體，RNAi載體導(dǎo)入體內(nèi)后持續(xù)轉(zhuǎn)錄出shRNA， shRNA被RNase III家族的內(nèi)切核酸酶Dicer剪切成siRNA，從而引發(fā)較長時(shí)間的RNA沉默效 果。因此，利用RNAi技術(shù)，以目的基因?yàn)榘袠?biāo)構(gòu)建RNAi載體，再將其導(dǎo)入家蠶細(xì)胞并持續(xù) 表達(dá)能夠?qū)е履康幕?mRNA降解的siRNA，是防治家蠶感染BmNPV和培育家蠶抗病毒品系 的一種有效手段?；蜻^表達(dá)是指將基因序列插入到宿主適用的啟動(dòng)子后，構(gòu)建目的基因 的表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使目的基因在宿主中的表達(dá)量上調(diào)。利用 過表達(dá)技術(shù)將BmNPV抗性基因?qū)爰倚Q細(xì)胞以增強(qiáng)的家蠶細(xì)胞的BmNPV抗性，同樣也是防 治家蠶感染BmNPV和培育家蠶抗病毒品系的一種有效手段。
[0004] 近年來，研宄者對REEP基因的研宄只局限于哺乳動(dòng)物中其對受體的增強(qiáng)作用和 與各類神經(jīng)性疾病的關(guān)系；昆蟲中，只有果蠅中有研宄指出果蠅的REEPl基因與果蠅的抗 逆性相關(guān)。但迄今為止，尚未見有關(guān)家蠶BmREEP基因及其功能的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供家蠶受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白BmREEPa基因；本 發(fā)明的目的之二在于提供含有家蠶受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白BmREEPa基因的重組表達(dá)載體；本 發(fā)明的目的之三在于提供含有上述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子；本發(fā)明的目的之四在于提供 BmREEPa基因干擾序列或干擾BmREEPa基因表達(dá)的RNA干擾載體在制備抗核型多角體病毒 家蠶或家蠶細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)過研宄后本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 1、家蠶受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白BmREEPa基因，所述BmREEPa基因包括BmREEPa-L和 BmREEPa-S兩種剪切體，所述BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述BmREEPa-S 的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 2、含有所述家蠶受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白BmREEPa基因的重組表達(dá)載體。
[0009] 進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體為干擾BmREEPa基因表達(dá)的干擾載體或含有BmREEPa 基因編碼區(qū)的過表達(dá)載體。
[0010] 進(jìn)一步，所述干擾BmREEPa基因表達(dá)的干擾載體為將BmREEPa基因干擾序列連 入經(jīng)改造的pIZ/V5-His載體而得，所述改造的pIZ/V5-His載體是在pIZ/V5-His載體的 HindIII和KpnI之間連入紅色熒光蛋白Dsred表達(dá)框的載體。
[0011] 進(jìn)一步，所述BmREEPa基因干擾序列如SEQ ID No. 5所示。
[0012] 進(jìn)一步，所述含有BmREEPa基因編碼區(qū)的過表達(dá)載體是將SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示序列連入pIZ/V5-His載體多克隆酶切位點(diǎn)處而得。
[0013] 3、含有所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
[0014] 4、BmREEPa基因干擾序列或干擾BmREEPa基因表達(dá)的RNA干擾載體在制備抗核型 多角體病毒家蠶或家蠶細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0015] 進(jìn)一步，所述干擾BmREEPa基因表達(dá)的RNA干擾載體為將BmREEPa基因干擾序列 連入經(jīng)改造的pIZ/V5-His載體而得，所述改造的pIZ/V5-His載體是在pIZ/V5-His載體的 HindIII和KpnI之間連入紅色熒光蛋白Dsred表達(dá)框的載體；所述BmREEPa基因干擾序列 如 SEQ ID No. 5 所示。
[0016] 更進(jìn)一步，所述家蠶細(xì)胞為家蠶卵巢細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一個(gè)與BmNPV感染高度相關(guān)的宿主基因， 能夠改變家蠶細(xì)胞對BmNPV的感染能力。利用本發(fā)明的RNAi載體，可以使家蠶細(xì)胞對BmNPV 的感染能力下降，達(dá)到抗BmNPV的效果；同時(shí)也可能為家蠶抗逆性的研宄提供新的素材。
【附圖說明】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0019] 圖1為BmREEPa基因兩種剪切體的序列比對結(jié)果。
[0020] 圖2為BmREEPa基因干涉與過表達(dá)載體的效果檢測。
[0021] 圖3為Control、導(dǎo)入BmREEPa干涉載體、導(dǎo)入BmREEPa過表達(dá)載體后感染BmNPV 后48h的熒光圖（A為熒光視野，B為白光視野）。
[0022] 圖4為Control、導(dǎo)入BmREEPa干涉載體、導(dǎo)入BmREEPa過表達(dá)載體后感染BmNPV 48h病毒滴度測定結(jié)果。
[0023] 圖5為Control、導(dǎo)入BmREEPa干涉載體、導(dǎo)入BmREEPa過表達(dá)載體后感染BmNPV 后48h Vp39基因的定量檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實(shí)施例UBmREEPa基因的克隆
[0026] 從silkDB和transDB中確定其mRNA序列。通過Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)如 下PCR特異引物：上游引物BmREEPa-F :5'_tcacattcggttagccactaaaag_3'（SEQ ID No. 3)， 下游引物 BmREEPa-R :5' -cgcataagcgaagtgctgaaa-3'（SEQ ID No. 4)。然后以感染 BmNPV 的家蠶全蠶cDNA為模板，以BmREEPa-F和BmREEPa-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序 為：94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，共35個(gè)循 環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化 后，與PMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-Tl感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉 素（Amp)的LB平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，用含有Amp的LB培養(yǎng)基過夜培 養(yǎng)后提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得的序列為兩個(gè)剪切體形式，分別命 名為BmREEPa-L和BmREEPa-S，其核苷酸序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,形成的 質(zhì)粒分別命名為pMD19-T-BmREEPa-L和pMD19-T-BmREEPa-S。將測序獲得的BmREEPa-L和 BmREEPa-S進(jìn)行比對，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，BmREEPa-S在序列內(nèi)部缺失108bp的序 列，其他序列完全相同，表明了 BmREEPa-L和BmREEPa-S是兩個(gè)不同的剪切體。
[0027] 實(shí)施例2、BmREEPa干涉載體和過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0028] 1、BmREEPa基因干涉載體的構(gòu)建
[0029] 根據(jù)BmREEPa基因的序列設(shè)計(jì)3個(gè)