苦瓜抗霜霉病基因片段或基因標記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是利用抗病基因同源序列方法，克隆苦瓜抗霜霉病基因片段或者將其轉(zhuǎn)化 為分子標記等，主要涉及苦瓜常規(guī)雜交育種，分子標記輔助育種，抗霜霉病基因的定位和分 子作圖，抗霜霉病基因的克隆以及抗病基因的調(diào)控機理分析等方面，屬于植物生物技術(shù)科 學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 霜霉病是苦瓜生產(chǎn)上最重要的病害之一。葉片上發(fā)病。初生淡黃色病斑，老化后變 黃褐色，病斑連接后干枯。葉背面病斑受葉脈限制呈多角形，潮濕時其上產(chǎn)生稀疏灰色霉， 與其他病害易區(qū)別。南方在瓜類作物上周年發(fā)生。北方除本地保護地瓜類蔬菜上展轉(zhuǎn)發(fā)生 夕卜，孢子囊借季風遠距離傳播。在田間，病菌借風雨傳播。保護地栽培密植、通風不良、空氣 濕度高，病勢發(fā)展快。露地栽培一般遇連陰雨后發(fā)病。排水不良、土壤水分高、瓜秧生長不 良等地發(fā)病較重。霜霉病嚴重影響了苦瓜植株的正常的生長發(fā)育過程，給生產(chǎn)帶來極大的 經(jīng)濟損失?？共』虻睦眉翱共∮N是苦瓜病害防治最有效的方法。
[0003] 二十世紀四十年代，F(xiàn)lor提出了經(jīng)典的"基因?qū)?理論學說，即植物和病原 菌體內(nèi)各自存在一個顯性基因，植物抗病基因或病菌無毒性（Avr)基因的缺失或改變都能 引起病害的產(chǎn)生。這個模型適用于大多數(shù)活體營養(yǎng)型病原菌，包括病毒、細菌、真菌和線蟲 類。"基因?qū)?抗病性一般是受體被作為模型：植物抗病蛋白能夠直接或間接的識別源 自病菌的Avr產(chǎn)物。一旦這種識別發(fā)生，就會引起防御反應(yīng)。大多數(shù)抗病基因 （Resistance gene ;R)觸發(fā)的抗性與快速防御反應(yīng)相關(guān)，稱為過敏性反應(yīng)（hypersensitive response ; HR)。而目前，大多數(shù)抗病基因的產(chǎn)物都含有蛋白識別的結(jié)構(gòu)域，如富含亮氨酸的重復單位 (LRR)的結(jié)構(gòu)域或卷曲螺旋（CC)的結(jié)構(gòu)域；信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域，如核苷酸結(jié)合部位（NBS)或 蛋白激酶（PK)結(jié)構(gòu)域。一些抗病基因產(chǎn)物被預測為細胞質(zhì)蛋白，而另一些通過一個跨膜結(jié) 構(gòu)域（TM)貫穿細胞膜。這些結(jié)構(gòu)域組合能夠產(chǎn)生不同類型的R蛋白。根據(jù)結(jié)構(gòu)的特性已 經(jīng)鑒定出至少六種不同類型的 R 基因：I) NBS-LRR，2) LRR-TM-PK，3) LRR-TM，4) CC-TM，5) PK， 6)PK-PK。其中，NBS-LRR類抗病基因是植物體內(nèi)存在的最大一類抗病基因；這些抗病基因 在結(jié)構(gòu)上的保守性為我們利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因帶來了潛在 可能。在已知分離獲得的抗病基因中，小麥抗葉銹病基因 LrlO和馬鈴薯抗馬鈴薯X病毒基 因 Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的經(jīng)典例子，說明利用該法克隆抗病基 因是可行的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問題
[0005] 本發(fā)明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鑒定苦瓜霜霉病基因片段或者將 其轉(zhuǎn)化為分子標記及應(yīng)用。結(jié)果一方面可用于苦瓜抗霜霉病分子標記輔助選擇育種，另一 方面也為抗霜霉病基因的克隆提供參考依據(jù)。
[0006] 技術(shù)方案
[0007] 本發(fā)明前期對大量苦瓜種質(zhì)資源進行抗病性篩選，在獲得高抗苦瓜霜霉病抗病種 質(zhì)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用抗病基因同源序列法克隆抗霜霉病基因片段，通過與已知抗病基因同源 性及序列比對分析等方法確認；為開發(fā)相應(yīng)的分子標記和利用cDNA末端快速擴增技術(shù)獲 得抗病基因的全長奠定基礎(chǔ)。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用抗病基因同源序列法對苦瓜抗霜霉病基因進行克 隆，獲得了抗霜霉病基因片段或者基因標記1個，片段大小為509bp。以該基因片段序列為 基礎(chǔ)，開發(fā)相應(yīng)的分子標記，可以進行苦瓜抗霜霉病分子標記輔助選擇育種；同時利用基因 片段或者基因標記進行新的種質(zhì)資源的創(chuàng)新；結(jié)合已有的分子標記可以實現(xiàn)苦瓜抗霜霉病 基因的分子作圖；利用這些基因片段，通過設(shè)計基因特異引物，采用cDNA末端快速擴增技 術(shù)分離苦瓜抗霜霉病基因，為通過基因工程改良苦瓜的抗病性奠定基礎(chǔ)；也為最終解析苦 瓜抗霜霉病基因的分子機理提供了基因資源。
[0009] 本發(fā)明的積極效果：
[0010] 1)有利于快速開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標記。通過鑒定的苦瓜霜霉病基 因，開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標記（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子標記輔 助選擇，準確性高。
[0011] 2)縮短了苦瓜抗霜霉病基因的挖掘周期，有利于霜霉病基因的快速鑒定。采用常 規(guī)方法（圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。 本發(fā)明基于抗病基因同源序列方法快速挖掘苦瓜抗霜霉病基因，不僅可以縮短時間，還可 以提高霜霉病基因鑒定效率。
[0012] 3)有利于多抗性育種材料的創(chuàng)制?；谛妈b定的霜霉病基因開發(fā)的功能性分子標 記，結(jié)合已經(jīng)定位的其他抗病基因的分子標記，進行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種 年限，提1?育種效率。
[0013] 4)為闡述苦瓜抗霜霉病分子機制奠定了基礎(chǔ)。鑒定的苦瓜抗霜霉病基因，通過轉(zhuǎn) 基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)等研究 抗霜霉病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述苦瓜抗病毒的作用機理。
【附圖說明】
[0014] 圖1是苦瓜T25抗霜霉病基因序列；
【具體實施方式】
[0015] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出苦瓜抗霜霉病基因。具體實施過程如下：
[0016] 1、DNA的提?。喝∵m量的苦瓜的幼嫩葉片硅膠干燥后研磨成粉狀，用CTAB法提取 總基因組DNA。提取的DNA用紫外分光光度計檢測，選取0D260/0D280值在1. 8?2. 0的樣 品于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0017] 2、抗病基因同源片段的擴增和克隆：根據(jù)已知的NBS-LRR型抗病基因的保守 區(qū)的氨基酸序列GG (L/I/V/M/S) GKTT和G (L/N) PL (A/T/S) (L/V)，設(shè)計了 1對簡并引物： NBS15，-GKTT GGIGGIWSIGGIAARACIACG-3'和 NBS25，-GCIGCIIARIGGRTTICC-3 '。取 苦瓜基因組DNA50ng為模板，按下列程序進行PCR擴增反應(yīng)：94°C預變性3min ;94°C 30s， 55 °C 30s，72 °C 30s，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠電泳檢測，切 下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，用天根生物公司的膠回收試劑盒，按操作說明回收 純化目的DNA片段，回收產(chǎn)物用pMD-18T CloningKit (TAKARA公司）連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 至DH5 α感受態(tài)細胞，涂于含IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上（含100mg/LAMP)，37°C培 養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落，通過PCR檢測確定含有目的片段。篩選后隨機選取10個克隆進 行測序（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。
[0018] 3、序列分析將測序結(jié)果去除PMD18-T載體序列，得到插入片段的DNA序列。用 ORFfinder分析這些序列的開放閱讀框，然后通過互聯(lián)網(wǎng)用BLAST軟件（網(wǎng)址：http:// www. n chi. nlm. nih. gov)與GenBank中登記的序列進行同源性比較，繼而推斷這些擴增產(chǎn) 物是否與已知的抗病基因相關(guān)。：
[0019] 以下是發(fā)明人給出的實施范例，但不局限于這些范例。
[0020] 實施范例1 :
[0021] 我們和國外農(nóng)業(yè)高校、科研院所合作，以優(yōu)良親本構(gòu)建了苦瓜的F2群體，含有120 個單株；以這些單株為試驗材料提取DNA，根據(jù)獲得的抗霜霉病基因序列設(shè)計特異引物，進 行PCR擴增，根據(jù)特異DNA片段在群體單株中分離情況，依據(jù)苦瓜霜霉病抗病性鑒定結(jié)果， 獲得與苦瓜抗霜霉病緊密連鎖的DNA片段。
[0022] 實施范例2 :
[0023] 在種質(zhì)資源創(chuàng)制過程中，以感病親本和抗病親本雜交獲得的后代個體為對象，提 取各自的基因組DNA，根據(jù)實施范例1獲得的與霜霉病基因緊密連鎖的DNA片段設(shè)計引物， 對上述獲得的苦瓜基因組DNA進行PCR擴增，凡是擴增產(chǎn)物出現(xiàn)DNA特異片段的雜種材料， 抗霜霉病雜種植株，或者是抗霜霉病基因的攜帶者，這些材料科研進一步用于抗病品種培 育的親本和育種種質(zhì)，實現(xiàn)了分子標記輔助選擇。
[0024] 實施范例3 :
[0025] 我們采用人工接種和田間接種鑒定相結(jié)合的方法，對上述的重組自交系群體進行 接種鑒定，根據(jù)實施范例1獲得的與霜霉病緊密連鎖的DNA片段，設(shè)計特異引物，對上述單 株個體進行PCR擴增；結(jié)合廣泛的分子標記如AFLP、SRAP等，分析這些標記在單株群體中的 分離情況，結(jié)合人工接種和田間接種鑒定結(jié)果，利用MAPMARKER軟件進行苦瓜抗霜霉病基 因的分子作圖，獲得霜霉病抗病區(qū)段的遺傳圖譜，為后續(xù)克隆抗病基因奠定基礎(chǔ)。
[0026] 實施范例4 :
[0027] 應(yīng)用北京天根公司RNA提取試劑盒提取抗霜霉病親本葉片總RNA，利用cDNA合 成試劑盒合成cDNA第一鏈；將實施范例1獲得的苦瓜抗霜霉病基因片段DNA序列，設(shè)計 特異引物，結(jié)合cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE技術(shù)）試劑盒所帶的引物相結(jié)合，分別進行 5 ' RACE和3 ' RACE PCR擴增，PCR產(chǎn)物分別在1 %的瓊脂糖凝膠電泳獲得5 ' RACE和3 ' RACE 全長序列。分別回收PCR產(chǎn)物，進行T克隆，獲得全長序列后進行基因全長的連接；從而克 隆了苦瓜抗霜霉病基因全長，為通過基因工程改良苦瓜品種的抗病性提供了基因資源。
【主權(quán)項】
1. 苦瓜抗霜霉病基因片段或者基因標記，其特征在于選自下列基因片段或者基因標記 之一：
2. 權(quán)利要求1所述快速鑒定苦瓜霜霉病的應(yīng)用，包括： 1) 攜帶有上述1個基因的育種材料的創(chuàng)制或者新品種創(chuàng)制：利用權(quán)利1所給出的基因 源為親本材料，在雜交、回交后代中，可以獲得轉(zhuǎn)育有霜霉病抗性基因的育種材料。 2) 抗霜霉病基礎(chǔ)理論研究：對權(quán)利1的1個霜霉病基因進行分子標記分析；對該基因 進行分子作圖或者基因定位；對該基因進行克隆以及基因間互作分析。 3) 抗霜霉病轉(zhuǎn)基因研究：利用權(quán)利要求1所給出的1個基因進行轉(zhuǎn)基因研究。
【專利摘要】本發(fā)明主要涉及到苦瓜抗霜霉病基因片段或基因標記及應(yīng)用；主要是采用抗病基因同源序列法，快速分離苦瓜抗霜霉病基因片段或基因標記1個，通過測序，這些基因片段或基因標記的核苷酸長度為509bp。該發(fā)明有效的縮短了苦瓜抗霜霉病基因挖掘周期，有利于霜霉病基因的快速鑒定；通過鑒定的霜霉病基因開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標記(SNP、SCAR等)，還可以快速的用于抗霜霉病基因的分子標記輔助選擇，準確性高；結(jié)合其它抗病基因分子標記可進行多抗性育種材料的創(chuàng)制，縮短育種年限，提高育種效率；為闡述苦瓜抗霜霉病基因分子機制奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-29, C12Q1-68
【公開號】CN104561028
【申請?zhí)枴緾N201310524771
【發(fā)明人】錢孝英, 錢春桃
【申請人】常熟市董浜東盾蔬菜專業(yè)合作社
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月28日