水稻b3轉(zhuǎn)錄因子家族基因rav2的應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種水稻B3轉(zhuǎn)錄因子家族基因 RAV2的 應用。本發(fā)明通過正向遺傳學方法，從水稻中得到了一個控制水稻葉夾角的基因 RAV2,并通 過轉(zhuǎn)基因互補試驗證明了 RAV2基因的功能；本發(fā)明還涉及利用該基因或其功能類似基因 來培育具有不同葉夾角水稻的方法。本發(fā)明的水稻B3轉(zhuǎn)錄因子家族基因 RAV2與水稻株型 相關，對豐富水稻株型資源具有重要意義。
【背景技術(shù)】
[0002] B3類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，因其含有Bl、B2和B3結(jié)構(gòu)域而 得名，可分為 5 個亞族：ABI3/VP1 ;HSI (High-level expression of 互ugar-inducible gene) ；RAV(Related to ABI3/VP1) ；ARF(Auxin Response Factor)and REM(Reproductive Meristem)。擬南芥的研宄表明，它們的功能涉及植物激素的合成以及信號轉(zhuǎn)導、種子發(fā) 育、開花調(diào)控、生物和非生物的脅迫應答等，在植物的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用 (RomaneI, E. A. C., et al. , Evolution of the B3 DNA Binding SuperfamiIy: New Insights into REM Family Gene Diversification.PLoS ONE, 2009,4(6):e5791)〇
[0003] 水稻的B3基因家族有91個成員，其中RAV亞家族有12個基因（Romanel，E. A.C. , et al., Evolution of the B3DNA Binding Superfamily:New Insights into REM Family Gene Diversification. PLoS ONE, 2009,4(6):e5791) 〇
[0004] 發(fā)明人分析了水稻RAV亞家族的12個基因的研宄情況，并對其所在的基因組位置 與RAV2進行了比較。結(jié)果顯示，僅有位于第4染色體的RAVLl (L0C_0s04g49230)基因有相 關的功能研宄。研宄表明，轉(zhuǎn)錄因子RAVLl(L0C_0s04g49230)通過調(diào)節(jié)參與BR信號途徑和 合成途徑基因的表達，來維持細胞內(nèi)BR穩(wěn)態(tài)平衡（Je，B. I.，et al.，RAV-LikelMaintains Brassinosteroid Homeostasis via the Coordinated Activation of BRIland Biosynthetic Genes in Rice. The Plant Cell Online, 2010. 22(6):p. 1777-1791)〇RAVLl 的Ds插入缺失突變體主要表現(xiàn)為葉色暗綠，半矮桿等性狀。
[0005] 葉片形態(tài)是影響株型的主要因素，而葉傾角影響植株空間伸展姿態(tài)，是葉片形態(tài) 的重要組成部分。通過對葉角突變體的研宄發(fā)現(xiàn)，絕大部分突變基因都參與了油菜素內(nèi) 酯（BR)的生物合成與信號傳導途徑，包括LC2、0sBRIl、0sLICl、0sBAKl、BUl、ILIl等（徐 靜等.水稻葉片形態(tài)建成分子調(diào)控機制研宄進展.作物學報，2013, 39 (5): 767-774)。這 些基因通過調(diào)節(jié)葉枕（葉片與葉鞘的連接處）近軸面細胞的分裂與生長，進而影響葉片 傾角。此外，ILAl是通過影響葉枕機械組織強度進而改變?nèi)~角的基因，且該基因與油菜素 內(nèi)酉旨的反應無關（Ning J, Zhang B, Wang N, et al. Increased leaf anglel, a Raf-Iike MAPKKK that interacts with a nuclear protein family, regulates mechanical tissue formation in the lamina joint of rice. Plant Cell. 2011, 23(12):4334-4347)。另一個 影響葉片與葉鞘連接處發(fā)育且與油菜素內(nèi)酯反應無關的基因 TLDl也起調(diào)節(jié)葉角大小的作 用（Zhang, et al. Altered architecture and enhanced drought tolerance in rice via the down-regulation of indole-3-acetic acid by TLD1/0SGH3. 13activation. Plant Physiol，2009, 151 (4) : 1889-1901)。因此，葉角大小的調(diào)控是一個復雜的過程，在很大程 度上受葉枕發(fā)育的影響，在這過程中植物內(nèi)源植物激素油菜素內(nèi)酯又起著很重要的調(diào)節(jié)作 用。
[0006] 要全面了解株型調(diào)控作用機理，需要鑒定和克隆更多的相關基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種水稻B3轉(zhuǎn)錄 因子家族基因 RAV2及其編碼蛋白。本發(fā)明從野生型水稻中花11的后代中篩選到一個突變 體rav2,該突變體不僅植株矮化而且葉片下垂。遺傳分析表明，該突變?yōu)椴煌耆@性遺傳。 利用圖位克隆策略已獲得突變體候選基因 RAV2 (L0C_0s02g45850)，該基因?qū)儆贐3類轉(zhuǎn)錄 因子家族的RAV亞家族。因此，本發(fā)明的目的基因0sRAV2位于水稻第2染色體，是一個調(diào) 節(jié)水稻株型的新基因。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述水稻B3轉(zhuǎn)錄因子家族基因 RAV2在調(diào)節(jié)植物葉 夾角中的的應用。本發(fā)明的目的基因 RAV2屬B3類轉(zhuǎn)錄因子家族，相應的突變體株高明顯 變矮，而且葉片下垂，預示RAV2在水稻株型調(diào)控中具有重要作用。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述水稻B3轉(zhuǎn)錄因子家族基因 RAV2在植物育種中的 應用。
[0010] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述水稻B3轉(zhuǎn)錄因子家族基因 RAV2在培育轉(zhuǎn)基因植 物中的應用。
[0011] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0012] 本發(fā)明利用水稻自然變異突變體，通過圖位克隆策略確定該突變體候選基因位于 水稻第2染色體，屬于B3轉(zhuǎn)錄因子基因家族的RAV亞家族，命名為RAV2,目前尚沒有關于該 基因功能方面的研宄。
[0013] 基于上述說明，本發(fā)明提供一種水稻B3轉(zhuǎn)錄因子RAV2,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸替換、插入、缺 失而獲得的仍具有控制水稻葉夾角功能的類似物。
[0014] 上述水稻B3轉(zhuǎn)錄因子RAV2由水稻基因 RAV2編碼，該基因為下列A、B、C三種核苷 酸序列之一：
[0015] A序列表SEQ ID NO: 1所示的DNA序列；
[0016] B編碼與A編碼蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0017] C以上A和B通過堿基插入、缺失或替換而獲得的仍具有控制葉夾角功能的類似 物。
[0018] 含有上述水稻葉夾角相關蛋白編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和重組菌也屬 于本發(fā)明的保護范圍。
[0019] 上述水稻葉夾角基因 RAV2的應用，其方法是將含有RAV2基因的重組表達載體導 入植物細胞，獲得葉夾角改變的轉(zhuǎn)基因水稻；也可利用上述葉夾角改變的轉(zhuǎn)基因水稻作為 供體親本，通過回交選育法改良水稻葉夾角，即通過將所獲得的葉夾角改變的水稻與擬改 良的水稻品種（輪回親本）雜交，然后雜交后代經(jīng)多次與輪回親本雜交以選育葉夾角改變 的水稻。
[0020] 所述含有RAV2基因的重組表達載體可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建；所述植 物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如PCAMBIA1300、 pCAMBIA2300、pCUbi 1390等；含有RAV2基因的重組表達載體可通過基因槍、顯微注射、原生 質(zhì)體介導、花粉管通道、農(nóng)桿菌介導等各種物理、化學及生物學方法導入到宿主植物細胞或 組織中；所述宿主植物包括但不限于水稻、小麥、玉米、高粱、谷子、甘蔗、棉花、番茄、苜蓿和 象草；被導入的宿主植物優(yōu)選為水稻。
[0021] 在構(gòu)建含有RAV2基因的重組表達載體時，在RAV2基因的轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加 上任何一種增強型、組成型、組織特異性或誘導型啟動子，如35S啟動子、Ubi啟動子等。
[0022] 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 改造后再使用，包括加入GUS、GFP等報告基因、抗生素抗性基因或其它抗化學試劑標記基 因等。
[0023] 本發(fā)明通過圖位克隆方法首次從水稻中分離克隆了 RAV2基因，該基因編碼一個 水稻B3轉(zhuǎn)錄因子。突變體表型分析及互補分析表明RAV2基因在控制水稻葉夾角方面起重 要作用。另一方面，對該基因的研宄有助于人們了解水稻生長發(fā)育的分子機制，利用現(xiàn)代基 因工程方法，設計育種，對提高谷物產(chǎn)量具有重要作用。同時，利用該基因的功能特性，在水 稻中進行分子設計育種，選育適宜的水稻株型的品種具有很強的可操作性。
【附圖說明】
[0024] 圖1是水稻rav2突變體的表型；WT為野生型中花11 ;H為突變雜合體；M為突變 純合體。
[0025] 圖2是水稻基因 RAV2的圖位克隆的物理圖譜。
[0026] 圖3是水稻RAV2基因的表觀遺傳變異位點不意圖；灰色長方形部分顯不的為 RAV2基因（0s02g45850)的啟動子區(qū)發(fā)生了 DNA去甲基化的區(qū)域。
[0027] 圖4是水稻RAV2基因的表達分析圖；WT為野生型中花11 ;H為突變雜合體；M為 突變純合體。
[0028] 圖5是水稻RAV2基因過量表達轉(zhuǎn)基因植株表型；WT為野生型中花11 ;OE為過量 表達轉(zhuǎn)基因株系。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一