一種提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼的蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可提高白樺抗性的基因及其編碼的蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 白樺（Betula platyphylla Suk.)為樺木科樺屬植物，為落葉喬木，生長速度快、 是東北地區(qū)次生林的先鋒樹種，耐寒能力強(qiáng)，喜酸性土壤，在膠合板、單板的家具制造以及 紙漿材等方面有廣泛的應(yīng)用。由于其重要的生態(tài)、觀賞和實(shí)用經(jīng)濟(jì)價值，歷來被列為國家科 技計(jì)劃研宄的重要樹種之一。對白樺品種改良的范圍也在不斷擴(kuò)大，其主要目標(biāo)是培育速 生、優(yōu)質(zhì)和高抗的林木新白樺品種。但是傳統(tǒng)的品種改良手段存在效果不明顯，周期長，成 功率低的問題。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行遺傳改良可以解決上述問題，但首先需要找到在白 樺中能夠提升白樺性能的基因。
[0003] 轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是一類能識別真核生物基因啟動子區(qū)域中的順式作 用元件，并與之發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使一個特定轉(zhuǎn)錄因子在植物體 內(nèi)過量表達(dá)，就可通過該轉(zhuǎn)錄因子促使多個功能基因發(fā)揮作用，從而達(dá)到植物性狀獲得綜 合改良的效果。與過量表達(dá)個別功能基因相比，在植物體內(nèi)過量表達(dá)一個轉(zhuǎn)錄因子是提高 植物抗逆性更為有效的方法和途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼的蛋白，通過轉(zhuǎn)基 因技術(shù)為將來培育和改良高抗逆性白樺品種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0006] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 不O
[0007] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子全長為1281bp，編碼的蛋白分子由426個 氨基酸組成（SEQ ID NO :2)，等電點(diǎn)（PI)為6. 16,分子量（MW)為47. 98KD，負(fù)電荷殘基 (Asp+Glu)為 52,正電荷殘基（Arg+Lys)為 44,分子式為 C2tl93H3226N598O661S 2tl，不穩(wěn)定系數(shù)（II) 為54. 23,平均疏水性（GRAVY)為-0. 688,脂肪系數(shù)（Al)為62. 96。
[0008] 本發(fā)明提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子被命名為BpWNDl基因，實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明提高 白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子BpWNDl基因?qū)氚讟搴笫芨珊岛望}脅迫而明顯誘導(dǎo)表達(dá)，證明本 發(fā)明BpWNDl基因參與白樺的抗旱耐鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)。
[0009] 在非脅迫條件下本發(fā)明BpWNDl基因的轉(zhuǎn)基因白樺株系的生長狀況與野生型白樺 基本一致，說明該基因的大量表達(dá)不影響植物的生長；而在NaCl、ABA以及Mannitol的脅迫 條件下，BpWNDl過表達(dá)株系的白樺長勢明顯優(yōu)于野生型白樺。
[0010] 用本發(fā)明BpWNDl基因構(gòu)建植物過表達(dá)載體，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入野生型 白樺中，發(fā)現(xiàn)在非脅迫條件下過表達(dá)BpWNDl的轉(zhuǎn)基因白樺的生長狀況與野生型白樺基本 一致，說明該基因的大量表達(dá)不影響植物的生長；而過表達(dá)BpWNDl的轉(zhuǎn)基因白樺受NaCl、 ABA和Mannitol脅迫后白樺的長勢優(yōu)于對照組野生型白樺。在非生物脅迫下過表達(dá)BpWNDl 的轉(zhuǎn)基因白樺株能夠降低體內(nèi)過氧化氫和活性氧的積累，細(xì)胞損傷程度較低，表現(xiàn)出較強(qiáng) 的抗逆能力。
【附圖說明】
[0011] 圖1是【具體實(shí)施方式】二中在非脅迫條件（Control)下和在NaCl、ABA、Mannitol的 脅迫條件下陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株（0E3和0E8)與野生型白樺植株（WT)的生長狀況圖。
[0012] 圖2是【具體實(shí)施方式】二中DAB染色試驗(yàn)的染色結(jié)果圖。
[0013] 圖3是【具體實(shí)施方式】二中NBT染色試驗(yàn)的染色結(jié)果圖。
[0014] 圖4是【具體實(shí)施方式】二中Evans blue染色試驗(yàn)的染色結(jié)果圖。
[0015] 圖5是【具體實(shí)施方式】二中DCFH-DA染色試驗(yàn)的染色結(jié)果圖。
[0016] 圖6是【具體實(shí)施方式】二中PI染色試驗(yàn)的染色結(jié)果圖。
[0017] 圖7是【具體實(shí)施方式】二中SOD活性測定試驗(yàn)的活性檢測結(jié)果圖。
[0018] 圖8是【具體實(shí)施方式】二中POD活性測定試驗(yàn)的活性檢測結(jié)果圖。
[0019] 圖9是【具體實(shí)施方式】二中脯氨酸（proline)含量測定試驗(yàn)的活性檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0021] 一：本實(shí)施方式提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子BpWNDl基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO :1所示。
[0022] 本實(shí)施方式提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子BpWNDl基因所編碼蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0023] 本實(shí)施方式BpWNDl基因全長為128Ibp，編碼的蛋白分子由426個氨基酸組成（SEQ ID N0:2)，等電點(diǎn)（PI)為6. 16,分子量（MW)為47. 98KD，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu)為52,正 電荷殘基（Arg+Lys)為44,分子式為C2tl93H 3226N598O661S2tl，不穩(wěn)定系數(shù)（II)為54. 23,平均疏 水性（GRAVY)為-0. 688,脂肪系數(shù)（Al)為62. 96。
【具體實(shí)施方式】 [0024] 二：本實(shí)施方式對提高白樺抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子BpWNDl基因進(jìn)行試 驗(yàn)：
[0025] 一、在轉(zhuǎn)錄因子BpWNDl基因上、下游分別引入酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成帶有酶切位點(diǎn) 的BpWNDl基因序列及引物；
[0026] 二、對轉(zhuǎn)錄因子BpWNDl基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min ;94°C 變性3〇8、58°0退火3〇8、72°0延伸211^11，循環(huán)30次；最后在72°0延伸71^11;
[0027] 三、收集到的DNA片段純化后與經(jīng)酶切的pR0K2載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO 菌株；
[0028] 四、PCR驗(yàn)證和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒（pR0K2-BpWNDl)用電導(dǎo)法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿 菌EHA105菌株中，得到陽性重組菌；
[0029] 五、步驟四獲得的陽性重組菌采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型白樺，并在含有 卡那霉素（kan)的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，壯苗后取2?3片葉子提取白樺DNA進(jìn)行PCR 檢測，含有BpWNDl基因的為陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系；
[0030] 六、將步驟五獲得的陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系和野生型白樺的組培苗轉(zhuǎn)移到正常的 1/2MS培養(yǎng)基，或含有80mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基中，或含有l(wèi)OOmmol/L Mannitol 的1/2MS固體培養(yǎng)基中，或含有50ymol/L ABA的1/2MS固體培養(yǎng)基中，在人工氣候室中培 養(yǎng)20d，觀察各植株的長勢情況，結(jié)果如圖1所示。
[0031] 本實(shí)施方式步驟四中正確的重組質(zhì)粒pR0K2-BpWNDl經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到與BpWNDl 基因大小一致的條帶（基因片段），再經(jīng)過測序，該片段與BpWNDl基因的核苷酸序列相同。
[0032] 本實(shí)施方式步驟五中壯苗后在苗高6?7cm時取2?3片葉子提取白樺DNA。
[0033] 本實(shí)施方式步驟五獲得16個陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系，本實(shí)施方式步驟六選用其中 的兩個陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系0E3和0E8的組培苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。在非脅迫條件 (Control)下陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株（0E3和0E8)的生長狀況與野生型白樺植株（WT)基 本保持一致；而在NaCl、ABA以及Mannitol的非生物脅迫條件下陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株 (0E3和0E8)的白樺長勢優(yōu)于野生型白樺植株（WT)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)表明BpWNDl 基因在白樺中可成功表達(dá)，不影響植物的生長，并使陽性轉(zhuǎn)基因白樺的抗逆性大幅提升。
[0034] 以培養(yǎng)4周的土培苗為材料，分別用水、濃度為200mmol/L的NaCl溶液、300mmol/ L的甘露醇溶液和100 μ mol/L的脫落酸（ΑΒΑ)溶液處理陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株（OE)和 野生型白樺植株，在人工氣候室中處理6h和12h后，取植株葉片分別進(jìn)行DAB、NBT、Evans blue等染色，結(jié)果如圖2?6所示。
[0035] 1)DAB 染色：
[0036] 分別取各脅迫處理0、6、12h的陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株（OE)和野生型白樺植株 (WT)葉片，置于離心管中，加入DAB染色液，室溫染色過夜。染色結(jié)束后，用75%乙醇與5% 甘油煮沸脫色。
[0037] 2) NBT 染色
[0038] 分別取各脅迫處理0、6、12h的陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株（OE)和野生型白樺植株 (WT)葉片，置于離心管中，加入NBT染色液，室溫染色過夜。染色結(jié)束后，用75%乙醇+5% 甘油沸水浴脫色。
[0039] 3) Evans blue 染色
[0040] 分別取各脅迫處理0、6、12h的陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株（OE)和野生型白樺植株 (WT)葉片，置于離心管中，加入Evans blue染色液，真空干燥15min，保持真空6h。染色結(jié) 束后，用96%乙醇沸水浴脫色。
[0041] 4) DCFH-DA 染色：
[0042] 分別撕取未脅迫處理和脅迫處理Ih的陽性轉(zhuǎn)基因白樺株系植株（0E3和0E8) 和野生型白樺植株（WT)葉片的下表皮，放入誘導(dǎo)氣孔開放液中2h，然后用