一種蝦y-器官7、8-脫氫酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝦Y-器官7、8_脫氫酶基因及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素03是人與動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、維持生命和保持健康必不可少的一種脂溶 性維生素。它的主要作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)腸內(nèi)鈣磷吸收和骨質(zhì)鈣化，維持血鈣和血磷 的平衡。此外，維生素 D3還是一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、拮 抗膠原形成以及調(diào)節(jié)原癌基因白表達(dá)、抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用。當(dāng)今，世界人口老齡化已成為 舉世矚目的社會(huì)問(wèn)題之一，對(duì)老年人用藥，國(guó)內(nèi)外都十分重視，老年人用藥中維生素 D3占據(jù) 著重要的地位。此外，隨著人們的生活水平不斷提高，對(duì)肉、蛋、禽的食用量增加，維生素 D3 作為飼料工業(yè)的添加劑之一有了更廣闊的市場(chǎng)，維生素 D3的需求量呈逐年上升趨勢(shì)。
[0003] 目前，維生素 D3主要采用光化學(xué)法進(jìn)行生產(chǎn)，即以7-脫氫膽固醇（7 - DHC)為原 料，經(jīng)紫外照射后轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素 D3前體（PreD3),再熱異構(gòu)化而得。作為主生產(chǎn)原料的7-脫 氫膽固醇，可采用多種不同的原料和工藝路線，通過(guò)化學(xué)合成法制備。如用6-烯膽留烽醇 為原料，先用4-苯基-1，2, 4-三唑啉-3, 5-二酮來(lái)保護(hù)6位上的雙鍵，再用NaHC03& Jone. s試劑（由CrO3及濃硫酸配成）氧化，再用硼氫化鈉還原，水解后得到7-脫氫膽固醇。我 國(guó)中科院感光化學(xué)所張建成等人則采取以膽固醇為基本原料，經(jīng)氧化、加成等一系列反應(yīng) 得到7-脫氫膽固醇的工藝路線。
[0004] 迄今為止，無(wú)論采用何種化學(xué)合成法制備原料7-脫氫膽固醇，均有工藝流程長(zhǎng)、 步驟多、副產(chǎn)物去除過(guò)程復(fù)雜、收率低、成本高和易污染環(huán)境的缺點(diǎn)，從而限制了維生素 D3 的生產(chǎn)和市場(chǎng)推廣。因此，開發(fā)出一種工藝路線短、成本低的7-脫氫膽固醇的生產(chǎn)方法變 得十分迫切和必要。
[0005] 基于昆蟲和節(jié)肢動(dòng)物蛻皮機(jī)理的研宄，從刀額新對(duì)奸（Metapenaeus ensis) Y-器 官cDNA文庫(kù)中克隆一種新的編碼7、8_脫氫酶的基因（以下簡(jiǎn)稱maf)，并在真核細(xì)胞中表 達(dá)得到7、8_脫氫酶，該7、8_脫氫酶能催化膽固醇7、8碳原子位脫氫，直接轉(zhuǎn)化膽固醇為 7-脫氫膽固醇。這樣的結(jié)果，十分有利于下一步研宄高酶活、低成本的脫氫酶制造方法，從 而開發(fā)一種新的生物法合成7-脫氫膽固醇工藝路線，降低7-脫氫膽固醇和維生素 D3生產(chǎn) 成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服上述技術(shù)的不足，提供了一種7、8_脫氫酶的基因及其 應(yīng)用，開發(fā)出一種工藝路線短、成本低的7-脫氫膽固醇生產(chǎn)路線。
[0007] 本發(fā)明解決問(wèn)題所采用的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種編碼7、8_脫氫酶基因，其是由已構(gòu)建的刀額新對(duì)蝦Y-器官 cDNA文庫(kù)中獲得，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種7、8-脫氫酶，其為編碼7、8-脫氫酶基因的表達(dá)產(chǎn)物，由428 個(gè)氨基酸組成，其分子量為49550. 09Da，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述重組表達(dá)質(zhì)粒是由表達(dá)質(zhì) 粒和權(quán)利要求1所述基因重組而得。
[0011] 優(yōu)選的是，所述表達(dá)質(zhì)粒為真核表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌而得基因工程菌 X33-pPICZa A-maf〇
[0013] 本發(fā)明還提供了 7、8_脫氫酶能水解膽固醇為7-脫氫膽固醇中的應(yīng)用，其酶解反 應(yīng)是在25°C，避光條件下反應(yīng)12h。
[0014] 一種利用編碼7、8_脫氫酶基因制備7、8_脫氫酶的方法，其特征在于，包含以下步 驟：
[0015] (1)克隆編碼7、8_脫氫酶的基因；
[0016] (2)將編碼7、8_脫氫酶基因與表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；
[0017] (3)將重組表達(dá)質(zhì)粒線性化與純化；
[0018] (4)將純化后的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌，篩選后獲得基因工程菌；
[0019] (5)將基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)，純化鑒定后獲得7、8_脫氫酶。
[0020] 優(yōu)選的是，步驟4)中所述的受體菌為畢赤酵母X-33。
[0021] 優(yōu)選的是，步驟5)中所述的基因工程菌X33-pPICZ a A-maf利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表 達(dá)。
[0022] 優(yōu)選的是，所述甲醇的濃度0.5% (v/v)。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是：
[0024] 1、本發(fā)明涉及到該7、8_脫氫酶基因克隆、與之相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列及其在受體 菌畢赤酵母X-33中的表達(dá)，該表達(dá)酶可以轉(zhuǎn)化膽固醇為7-脫氫膽固醇，為生物法合成 7_脫氫膽固醇提供了一種新的方法。
[0025] 2、本發(fā)明的7、8_脫氫酶的酶解法簡(jiǎn)單高效，實(shí)現(xiàn)一步酶法轉(zhuǎn)化膽固醇為7-脫氫 膽固醇，既提高其轉(zhuǎn)化效率、縮短維生素 D3的工藝路線，又減少環(huán)境污染；由于刀額新對(duì)蝦 來(lái)源廣泛，還能降低生產(chǎn)成本。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為重組質(zhì)粒PmlI、XbaI雙酶切和PCR鑒定圖，是以重組克隆載體為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物和pPICZaA分別經(jīng)過(guò)Pml I和XbaI進(jìn)行雙酶切，其結(jié)果通過(guò)0. 8 %瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)；其中 M 為 Maker λ Hind III ;第 1-4 孔為 Plasmid digested by Pmll/Xbal ; 第 5 孔為 MakerDL2000 ;第 6-9 孔為 PCR product of recombinant。
[0027] 圖2為重組子在畢赤酵母X-33(P.pastoris X-33)中表達(dá)圖，是用含空pPICZaA 載體的重組菌作為空白對(duì)照，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后提取菌體蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE分析；其中 M 為 Protein molecular weight markers ;第 1 孑L為 Medium supernatant of negative control ;第 2-8 孔為 Recombinant maf after 24, 36, 48, 60, 72, 84and 96h induction
[0028] 圖3為表達(dá)載體物理圖譜，是將重組基因轉(zhuǎn)化入P. pastoris X-33所用的質(zhì)粒載 體是pPICZaA,該質(zhì)粒具有如下特征：帶有Zeocin選擇標(biāo)記，3600bp，被克隆的基因受控于 AOXl啟動(dòng)子，帶有多克隆位點(diǎn)（ploylinker site)。
[0029] 圖4為酶促反應(yīng)液的高效液相色譜圖，是將酶促反應(yīng)液預(yù)處理后，用反相高效液 相色譜法檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，檢測(cè)條件為：C 18柱（5 ym，250mmX4. 6mm)，流動(dòng)相乙腈-異丙醇 (體積比7 : 3)，柱溫30°C，流速I. OmL/min，UV檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。
[0030] 圖5為標(biāo)品7-脫氫膽固醇的高效液相色譜圖；其中標(biāo)樣7-脫氫膽固醇反相高效 色譜法檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)條件為：C 18柱（5 ym，250mmX4. 6mm)，流動(dòng)相乙腈-異丙醇（體積比 7 : 3)，柱溫 30°C，流速 I. OmL/min，UV 檢測(cè)波長(zhǎng) 280nm。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 夕卜，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0032] 實(shí)施例:
[0033] 1、文庫(kù)來(lái)源和質(zhì)粒
[0034] 刀額新對(duì)奸（Metapenaeus ensis) Y-器官cDNA文庫(kù)和pPICZaA均由本實(shí)驗(yàn)室保 存。
[0035] 2、主要試劑
[0036] 表達(dá)宿主菌P. pastoris X-33 (野生型）、抗生素 Zeocin均購(gòu)自invitrogen公司。 Pm 11酶和XbaI酶均購(gòu)自TaKaRa生物工程公司。
[0037] 3、方'法
[0038] 3.1、基因的克隆與測(cè)序
[0039] 以自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為5-GCGCACGTGATGCTACTGGAACAGATT TGGG-3，下游引物為 5-GCGTCTAGAGCCCAGTCAAAAATTGATTTTGCTT-3。采用 25yL 的反應(yīng)體 系：10Xbuffer 2.5yL，dTNP 0.5yL，正反向