萊茵衣藻SelK表達載體及其構建方法和表達方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種萊茵衣藻SelK表達載體及其構建 方法和表達方法。
【背景技術】
[0002] 硒作為人和動物必需的一種微量元素，對許多生理功能起重要作用，并與多種疾 病密切相關，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病及心血管病等。硒主要通過各種硒蛋白發(fā)揮生物功 能，比如，目前所發(fā)現(xiàn)的硒蛋白中SelK硒蛋白出于在心肌細胞中參與應對氧化應激，在人 肝癌細胞中參與調節(jié)內(nèi)質網(wǎng)應激，在受體介導的免疫細胞活化過程中促進鈣流；以及參與 內(nèi)質網(wǎng)相關蛋白降解、參與調節(jié)巨噬細胞表面CD36棕櫚酰化，影響泡沫細胞的形成和動脈 粥樣化等重要功能體現(xiàn)，具有重要的應用價值。
[0003] 現(xiàn)有硒蛋白產(chǎn)品中，大多采用化學合成方法進行，產(chǎn)品除了存在成本高，產(chǎn)率低之 夕卜，更重要的由于脫離機體缺乏定向性；因此現(xiàn)有更多傾向于采用借助于原核表達系統(tǒng)、真 核酵母表達系統(tǒng)和哺乳細胞表達系統(tǒng)來實現(xiàn)基因的體外表達，進行大量合成。
[0004] 但是，由于和其他蛋白的表達相比、硒蛋白的表達有著一定得特殊性，終止密碼子 UGA編碼為Sec而不作為終止信號依賴于基因上的一個特殊順式作用元件SECIS ;而真核生 物硒蛋白基因結構有別于原核生物硒蛋白，并且表達機制上有著很大的差異不能兼容。因 此，用原核表達系統(tǒng)如大腸桿菌直接表達真核硒蛋白難度很大。而酵母和高等植物中不存 在硒蛋白表達機制，無法進行硒蛋白的表達。利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達真核硒蛋白， 不存在表達機制是否兼容的問題。但是硒蛋白的生產(chǎn)效率很低尚無法實現(xiàn)硒蛋白的大量表 達，也無法純化到蛋白。因此，硒蛋白的體外表達和合成的方法，不能滿足單一、高效、大量 的應用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實施例的目的在于克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種能夠以用萊茵衣藻 作為生產(chǎn)硒蛋白的反應器，進行動物硒蛋白大量表達的萊茵衣藻SelK表達載體及其構建 方法和表達方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術方案如下：
[0007] 一種萊茵衣藻SelK表達載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0008] 擴增人SelK的ORF基因片段，得ORF基因擴增產(chǎn)物；
[0009] 擴增萊茵衣藻SelWl的SECIS基因片段，得SECIS基因擴增產(chǎn)物；
[0010] 將所述ORF基因擴增產(chǎn)物和SECIS基因擴增產(chǎn)物進行重組，得到重組型SelK基 因；
[0011] 將所述重組型SelK基因導入可在萊茵衣藻中表達的質粒載體，形成重組質粒產(chǎn) 物。
[0012] 本發(fā)明方法所構建的萊茵衣藻SelK表達載體，構建出可以在萊茵衣藻中表達外 源目的硒蛋白K的新型質粒載體；相比現(xiàn)有的化學合成、原核表達系統(tǒng)等體外表達的載體 和方法，產(chǎn)物出于相似的表達機制產(chǎn)生，具有非常良好的單一性和定向性、效率大大提高。
[0013] 本發(fā)明進一步還提出一種根據(jù)上述方法所構建獲得的萊茵衣藻SelK表達載體。
[0014] 采用本發(fā)明的載體，表達時可以采用萊茵衣藻作為生產(chǎn)硒蛋白的反應器，便捷高 效；完全能滿足研宄砸蛋白的結構功能以及開發(fā)砸蛋白抗癌藥物的基礎。
[0015] 本發(fā)明進一步還提出一種上述萊茵衣藻SelK表達載體的表達方法，包括如下步 驟：
[0016] 將萊茵衣藻SelK表達載體用玻璃珠介導的方式與萊茵衣藻細胞進行轉化，形成 轉化態(tài)萊茵衣藻；
[0017] 將轉化態(tài)萊茵衣藻進行發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵過程中用Se化合物誘導SelK表達。
[0018] 本發(fā)明的表達方法，相比現(xiàn)有的化學合成、原核表達系統(tǒng)等體外表達的載體和方 法，產(chǎn)物出于相似的表達機制產(chǎn)生，具有非常良好的單一性和定向性、效率大大提高；并且 表達時可以采用萊茵衣藻作為生產(chǎn)硒蛋白的反應器，便捷高效；完全能滿足研宄硒蛋白的 結構功能以及開發(fā)硒蛋白抗癌藥物的基礎。
【附圖說明】
[0019] 下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0020] 圖1為本發(fā)明實施例采用的可在萊茵衣藻中表達的質粒載體PH124質粒圖譜；
[0021] 圖2為本發(fā)明實施例萊茵衣藻SelK表達載體的構建方法示意圖；
[0022] 圖3為本發(fā)明實施例人SelK的ORF片段的PCR產(chǎn)物電泳結果；
[0023] 圖4為本發(fā)明實施例提取的衣藻的總RNA凝膠電泳檢測結果圖；
[0024] 圖5為本發(fā)明實施例衣藻SelWl的SECIS片段的PCR產(chǎn)物電泳結果；
[0025] 圖6為本發(fā)明實施例進行ORF片段與SECIS片段重疊 PCR產(chǎn)物的電泳結果；
[0026] 圖7為本發(fā)明實施例陽性篩選中提取的質粒DNA的擴增產(chǎn)物的電泳結果；
[0027] 圖8為本發(fā)明實施例陽性篩選中質粒DNA的擴增產(chǎn)物雙酶切片段的電泳結果；
[0028] 圖9為本發(fā)明實施例陽性篩選中提取的陽性質粒DNA測序結果與人SelK的ORF 的NCBI Blast在線比對的結果圖；
[0029] 圖10為本發(fā)明實施例陽性篩選中提取的陽性質粒DNA測序結果與衣藻SelWl的 SEICS的NCBI Blast在線比對的結果圖；
[0030] 圖11為本發(fā)明實施例免疫印跡檢測轉基因衣藻中SelK的表達結果圖。
【具體實施方式】
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0032] 本發(fā)明實施例提供一種萊茵衣藻SelK表達載體的構建方法，其包括如下步驟：
[0033] S10,擴增人SelK的ORF基因片段，得ORF基因擴增產(chǎn)物；
[0034] S20,擴增萊茵衣藻SelWl的SECIS基因片段，得SECIS基因擴增產(chǎn)物；
[0035] S30,將ORF基因擴增產(chǎn)物和SECIS基因擴增產(chǎn)物進行重組，得到重組型SelK基 因；
[0036] S40,將重組型SelK基因導入可在萊茵衣藻中表達的質