OsAGO18基因在提高水稻對水稻條紋葉枯病抗性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及OsAGOIS基因在提高水稻對水稻條紋葉枯病抗性 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻條紋葉枯病是由灰飛虱為媒介傳播的，由水稻條紋病毒（Rice Stripe Virus，RSV)引起的病毒病，俗稱水稻上的癌癥。病株?？菰兴牖蛩胄』尾粚?。水稻苗期 發(fā)病之初在心葉基部呈現(xiàn)斷續(xù)的黃綠色或黃白色短條斑，以后病斑增大合并，擴(kuò)展成與葉 脈平行的黃綠色條紋，條紋間仍保持綠色；拔節(jié)后發(fā)病在劍葉下部出現(xiàn)黃綠色條紋，各類型 稻均不枯心，但抽穗畸形，結(jié)實很少。
[0003] 水稻條紋病毒（Rice Stripe Virus, RSV)，屬纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus)的代表種。 該病毒具有獨特的基因組結(jié)構(gòu)和編碼策略，基因組共有四條單鏈RNA，其中RNA2、RNA3和 RNA4均采取雙義編碼策略，即在RM的正義鏈和互補(bǔ)鏈均有0RF，都可以編碼蛋白。RNA2編 碼NS2和NSvc2蛋白，其功能不詳；RNA3編碼外殼蛋白NCP和RNA沉默抑制子NS3 ;RNA4編 碼的SP為病害特異蛋白，NSvc4為移動蛋白；RNAl只編碼一個RdRP蛋白。水稻條紋病毒 (RSV)是嚴(yán)重危害我國水稻生產(chǎn)的主要病毒之一。由于對水稻病毒和寄主之間的相互作用 機(jī)制缺乏系統(tǒng)了解，因而長期以來，尚無法設(shè)計出一些能徹底控制病毒病危害的策略。自上 世紀(jì)七十年代中期以來，分子生物學(xué)快速發(fā)展，使人們對于病毒基因結(jié)構(gòu)、病毒致病及植物 抗病機(jī)理等有了一定的了解，并啟發(fā)了利用基因工程手段防治病毒病的一系列策略，如利 用外殼蛋白介導(dǎo)的抗性及利用轉(zhuǎn)錄后的基因沉默介導(dǎo)的抗性等。隨著病毒全基因組序列的 分析完成、部分病毒重要功能基因的解析、水稻高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟應(yīng)用與突變體庫的 建成以及病毒與寄主相互作用機(jī)制，尤其是對轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制的認(rèn)識，為從轉(zhuǎn)基因分 子水平鑒定病毒基因致病性和其與寄主分子相互作用，以及從基因工程水平實施高效抗病 育種提供了創(chuàng)新可能。
[0004] 突變體是研究功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)，是分離基因和鑒定基因功能的重要途徑。自 20世紀(jì)70年代以來，全球建立了一系列的突變體庫。隨著水稻全基因組測序工作的完成， 水稻突變體已廣泛應(yīng)用于鑒定調(diào)控水稻形態(tài)和生理性狀與基因的連鎖分析及其相關(guān)基因 的克隆和功能研究。與水稻表達(dá)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，通過對植物抗病相關(guān)基因的突變體進(jìn)行篩 選及轉(zhuǎn)基因植物功能互補(bǔ)分析驗證，是研究抗病相關(guān)基因及其作用的分子遺傳機(jī)制的重要 途徑。
[0005] RNA沉默是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種非常重要的策略，也是植物抵抗病毒侵 染的一個方法。研究病毒和寄主之間在RNA沉默和RNA沉默的抑制對了解真核生物的基因 表達(dá)調(diào)控將有重要的推動作用。該技術(shù)目前已被國際研究領(lǐng)域公認(rèn)并應(yīng)用于抗病基因工程 育種以及功能基因研究。經(jīng)典遺傳學(xué)實驗材料進(jìn)行的RNA沉默實驗顯示了 RNA沉默的幾 個特點：特異、高效、可擴(kuò)散。與先前的正義或反義RNA技術(shù)相比，RNA沉默技術(shù)或人工構(gòu) 建miRNA等對同源基因表達(dá)的抑制效應(yīng)至少高10倍以上。如何快速、高效地構(gòu)建目標(biāo)基因 的反向重復(fù)序列，就成了當(dāng)前利用RNA沉默機(jī)制獲取對相關(guān)病毒免疫的工程植株的關(guān)鍵步 驟。
[0006] 在RNA沉默過程中包含了 3個主要元件：分別為DCLs、AGO和RDR，其在植物抗病 毒防御中都發(fā)揮重要作用。Dicer (DCLs)是一種III型內(nèi)切核酸酶，可以特異性識別生物體 內(nèi)的雙鏈RNA，或單鏈RNA折疊形成的雙鏈區(qū)域，產(chǎn)生長度為20?25nt的小RNA。所有的 Dicer都具有一個同源的核酶結(jié)構(gòu)域：RNase III結(jié)構(gòu)域。這個結(jié)構(gòu)域可以切割雙鏈RNA產(chǎn) 生duplex片段，切割產(chǎn)物一般具有5'磷酸集團(tuán)及具有2個堿基突起的3'末端。大多數(shù)病 毒在侵染復(fù)制過程中都會產(chǎn)生dsRNA形式，而這種dsRNA又會被生物體內(nèi)的Dicer (DCL2、 DCL3 和 DCL4 等）識別并切割生成 vsiRNA (virus-derived small interfering RNAs)，從 而阻斷病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。Argonaute (AGO)蛋白，一個RNA結(jié)合蛋白，大小在90? IOOkDa,是RNA沉默過程中的核心組分可以與siRNA，miRNA或piRNA結(jié)合，形成有活性的 RISC(RNA-induced silencing complexXRDR，RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDR)，以RNA單鏈為模板合成dsRNA，在DCLs切割下產(chǎn)生small RNAs。最新的研 究結(jié)果揭示，病毒和宿主RDRs合成的dsRNA作為主要的切割底物，以及源于R Vaistijand Jones DR6介導(dǎo)產(chǎn)生的dsRNA所產(chǎn)生的次級siRNAs具有更加有效的抗病毒反應(yīng)。然而，這 可能不是普遍現(xiàn)象，其結(jié)果可能取決于對特定的病毒。在病毒與寄主的長期進(jìn)化過程中， RNA沉默（RNA silencing)成為植物抵抗病毒侵染的一種保守的防御機(jī)制。而作為相互競 爭的另一方，病毒也不會坐以待斃，現(xiàn)在認(rèn)為絕大多數(shù)的病毒都會編碼一種抑制基因沉默 的蛋白因子（VSR)，這種蛋白因子通過各種不同的方式作用于RNA沉默通路的不同位點從 而抑制RNA沉默對病毒的切割。
[0007] 在水稻病毒的研究中，最新的研究顯示在miRNA水平上水稻矮縮病毒（Rice dwarf virus, RDV)和水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV)可能在致病機(jī)制上存在很大差異， RDV侵染水稻后對水稻miRNA影響并不明顯，而RSV決然相反，它不但極大的影響了水稻 miRNA的變化，而且還誘導(dǎo)了大量HiiRNAi" (miRNA star)和新的Phased MicroRNAs的產(chǎn)生， 并且這些miRNA#和Phased MicroRNAs在RSV侵染條件下能夠有效調(diào)控其靶基因的變化， 這些新的發(fā)現(xiàn)則告訴我們dsRNA病毒和ssRNA病毒在致病機(jī)制上存在明顯差異，并且水稻 miRNA參與了 RSV的抗病毒防御防御（Du et al.，2011)。
[0008] Solexa測序技術(shù)是深度測序技術(shù)中的一種，屬于第二代測序技術(shù)，它們的興起與 發(fā)展為基因組與RNA研究提供了非常好的工具，通過該技術(shù)可以高通量測定核苷酸的序 列，此方法不僅在小RNA測序中得到廣泛應(yīng)用，而且在研究基因組甲基化，轉(zhuǎn)綠組和基因組 重測序中也占據(jù)絕對優(yōu)勢。深度測序技術(shù)可以揭示RSV和水稻互作過程中的許多信息，t匕 如水稻RNA沉默相關(guān)蛋白在抗病防御中的作用。在深度測序前需要構(gòu)建小RNA庫和mRNA 庫，首先提取分別提取感染RSV的水稻和健康水稻組織中的總RNA，分別構(gòu)建mRNA和小RNA 庫，在其兩端接上接頭，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。得到的cDNA進(jìn)行深度高通量測序。
[0009] 隨著高通量分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，它帶給我們將是海量的數(shù)據(jù)信息，這些 信息的分析必需依靠強(qiáng)大的生物信息學(xué)平臺的支撐。水稻基因組和RSV基因組均已經(jīng)測序 完成，這為我們后續(xù)的生物信息學(xué)分析提供了很好的數(shù)據(jù)平臺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種OsAGOIS蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗水稻條紋葉 枯病中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為如下A或B :
[0012] A:蛋白質(zhì)在如下al)或a2)中的應(yīng)用：
[0013] al)調(diào)控植物對水稻條紋葉枯病的抗性；
[0014] a2)選育對水稻條紋葉枯病抗性增強(qiáng)的植物品種；
[0015] 所述蛋白質(zhì)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成或由序列表中序列4所示的 氨基酸序列組成。
[0016] B :蛋白質(zhì)的編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體，在如下al)或a2)中的應(yīng) 用：
[0017] al)調(diào)控植物對水稻條紋葉枯病的抗性；
[0018] a2)選育對水稻條紋葉枯病抗性增強(qiáng)的植物品種；
[0019] 所述蛋白質(zhì)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成或由序列表中序列4所示的 氨基酸序列組成。
[0020] 其中，由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成蛋白質(zhì)命名為0sAG018蛋白（編碼 基因為序列1，命名為0sAG018基因)，由序列表中序列4所不的氣基酸序列組成蛋白質(zhì)則為 在0sAG018蛋白的N端連接了 MYC標(biāo)簽后得到的融合蛋白（編碼基因為序列3)。
[0021] 在本發(fā)明中，以上所有al)中的所述調(diào)控植物對水稻條紋葉枯病的抗性均具體體 現(xiàn)在：促進(jìn)所述蛋白質(zhì)或其編碼基因的表達(dá)，則所述植物對水稻條紋葉枯病抗性增強(qiáng)。以上 所有a2)中的所述選育對水稻條紋葉枯病抗性增強(qiáng)的植物品種的方法，均具體可包括將所 述蛋白質(zhì)或其編碼基因的表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0022] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種培育對水稻條紋葉枯病抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物 的方法。
[0023] 本發(fā)明所提供的培育對