一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素k2的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素K(VK)是一類脂溶性化合物的統(tǒng)稱，該族含有2-甲基-1，4-萘醌環(huán)這一共同化學(xué)結(jié)構(gòu)，根據(jù)萘醌環(huán)3’位置側(cè)鏈長度不同又可以區(qū)分不同類別的VK。天然的VK包括VKl和VK2，前者為葉綠醌類(PK)，在動物的肝臟器官及綠色植物中分布較廣，顏色呈淡黃色，由腸道細(xì)菌合成；后者為甲萘醌類(MK)，根據(jù)結(jié)構(gòu)中C-3上異戊二烯側(cè)鏈的數(shù)目不同又可以分為MK-n系列。維生素Κ2的合成由萘醌環(huán)骨架合成途徑和異戊二烯側(cè)鏈合成途徑兩部分組成，其具有良好的促凝血、預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的功效，并對肝癌和白血病也有促進(jìn)治療作用，目前發(fā)現(xiàn)維生素Κ2對治療帕金森病有積極作用，近幾年的自然和科學(xué)雜志也發(fā)表了關(guān)于維生素Κ2功效的相關(guān)文章，這些文章指出，維生素Κ2具有修復(fù)損傷細(xì)胞這一新功能，這些臨床優(yōu)勢讓維生素Κ2在醫(yī)藥、食品保健等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0003]目前市場上維生素Κ2的合成主要采用化學(xué)合成手段，但是該方法同時存在環(huán)境污染及產(chǎn)物活性較低等不良問題。微生物法制備維生素Κ2相比化學(xué)合成法的優(yōu)勢在于原料成本低、條件要求溫和、環(huán)境污染少且產(chǎn)物具有較高生物活性。目前發(fā)酵領(lǐng)域中用于合成維生素Κ2的菌種包括革蘭氏陰性菌黃桿菌(主產(chǎn)ΜΚ-4)及革蘭氏陽性菌納豆芽孢桿菌(主產(chǎn)ΜΚ-6)。前者黃桿菌是野生菌株，其發(fā)酵能力較低，通過添加不同農(nóng)副產(chǎn)品的培養(yǎng)基制備能夠提高維生素Κ2產(chǎn)量。
[0004]花生衣和栗子衣即花生和栗子的種皮，具有降低纖維蛋白的溶解，增加血小板含量，促進(jìn)凝血，避免血小板大量聚集的功效，在臨床上能夠預(yù)防心血管疾病，其中所含有的不飽和脂肪酸可以降低血清膽固醇，防止血栓，這與維生素Κ2的部分功效相似。根據(jù)文獻(xiàn)得知，花生衣除了含有較多日糧蛋白質(zhì)和油脂以外，還含有VK成分，能夠?yàn)槲⑸锏纳L代謝提供有機(jī)氮源、維生素、無機(jī)鹽及一些其他輔助因子，添加在培養(yǎng)基中是一種提高微生物相關(guān)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的新方法。胡蘿卜渣、綠茶渣主要包括粗纖維物質(zhì)，臨床上能增加機(jī)體免疫力，抗癌及降低膽固醇。綠茶渣中含有茶多酚，它的物質(zhì)結(jié)構(gòu)與維生素Κ2的萘醌環(huán)相似，添加到培養(yǎng)基中可能作為前體營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)維生素Κ2的代謝。有文獻(xiàn)表明，黃豆渣添加在納豆芽孢桿菌中能增加維生素Κ2系列化合物之一 ΜΚ-7的產(chǎn)量，其含有的維生素K對黃桿菌產(chǎn)維生素Κ2代謝途徑有一定的促進(jìn)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素Κ2的發(fā)酵方法，提高黃桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素Κ2的代謝水平，為工業(yè)化制備維生素Κ2提供參考。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素Κ2的發(fā)酵方法，由以下步驟組成:
[0007](I)將黃桿菌接種于液體培養(yǎng)基進(jìn)行種子活化，在ρΗ7.0、培養(yǎng)溫度28-40°C條件下，培養(yǎng)2天，制備黃桿菌種子懸液；
[0008](2)將步驟(I)獲得的黃桿菌種子懸液接入添加食品加工廢渣的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在pH7.0、培養(yǎng)溫度28-40°C條件下，以轉(zhuǎn)速200搖瓶，在接種量在3-10%范圍內(nèi)，裝液量50ml/250ml，培養(yǎng) 6 天。
[0009]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(I)中，黃桿菌由中國典型培養(yǎng)物保藏管理中心提供，其編號為:CCTCC AB 2010137。
[0010]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，種子活化所采用液體培養(yǎng)基，其配方由以下組分組成:甘油20-30g/L、葡萄糖5-20g/L、魚粉蛋白胨10_20g/L、酵母浸膏1.5_3g/L、K2HPO44.5-5g/L、NaC13-4g/L，MgSO4.7H20 0.3-0.4g/L。
[0011]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基包含純花生衣粉、胡蘿卜渣粉、綠茶渣粉、黃豆渣粉、栗子衣粉中的一種或幾種，其含量為0.l-15g/L
[0012]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基包含純花生衣粉、胡蘿卜渣粉、綠茶渣粉、黃豆渣粉、栗子衣粉中的一種或幾種，其含量為0.4-12g/Lo
[0013]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方包括以下組分:甘油10-30g/L、麥芽糖 0-20g/L、魚粉蛋白胨 5-15g/L、酵母浸膏 l_2g/L、K2HPO4 3_6g/L，、NaCl
2-4g/L、MgSO4.7Η200.2-0.4g/L。
[0014]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的發(fā)酵方法，采用添加純花生衣粉、胡蘿卜渣粉、綠茶渣粉、黃豆渣粉、栗子衣粉中的一種或幾種的發(fā)酵培養(yǎng)基，使得發(fā)酵后黃桿菌相比原始菌產(chǎn)維生素K2水平提高。工藝成本較低，原料獲取相對容易，屬于食品加工廢渣，符合環(huán)保循環(huán)利用的特點(diǎn)，操作便捷，周期短，能夠大幅度提高維生素K2的發(fā)酵水平，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)維生素K2提供可能性，在醫(yī)療和食品保健領(lǐng)域具有應(yīng)用意義。
【附圖說明】
[0015]圖1為黃桿菌原始菌產(chǎn)物高效液相儀檢測圖譜。
[0016]圖2為本發(fā)明的實(shí)施例一培養(yǎng)基生長下的黃桿菌產(chǎn)物高效液相檢測圖。
[0017]圖3為本發(fā)明的實(shí)施例二培養(yǎng)基生長下的黃桿菌產(chǎn)物高效液相檢測圖。
[0018]圖4為本發(fā)明的實(shí)施例三培養(yǎng)基生長下的黃桿菌產(chǎn)物高效液相檢測圖。
[0019]圖5為本發(fā)明的實(shí)施例四培養(yǎng)基生長下的黃桿菌產(chǎn)物高效液相檢測圖。
[0020]圖6為本發(fā)明的實(shí)施例五培養(yǎng)基生長下的黃桿菌產(chǎn)物高效液相檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0022]實(shí)施例一
[0023]本實(shí)例包括以下步驟:
[0024](I)以黃桿菌(CCTCC AB 2010137)為出發(fā)菌，將黃桿菌接種于液體培養(yǎng)基中活化，其液體培養(yǎng)基成分為:甘油20g/L、葡萄糖10g/L、魚粉蛋白胨10g/L、酵母浸膏1.5g/L、K2HPO4 4.5g/L、NaC13g/L 和 MgS04.7H20 0.3g/L。在 PH7.0、培養(yǎng)溫度 28°C條件下，培養(yǎng)時間2天?；罨N子懸液
[0025](2)將步驟(I)獲得的黃桿菌菌株活化種子懸液，接入含有純花生衣粉和胡蘿卜渣粉的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，該發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:甘油20g/L、麥芽糖5g/L、魚粉蛋白胨1g/L、酵母浸膏 L 5g/L、K2HPO4 4.5g/L、NaCl 3g/L、MgSO4.7H20 0.3g/L、純花生衣粉 0.4g/L和胡蘿卜渣粉3g/L，在PH7.0、培養(yǎng)溫度37°C條件下，轉(zhuǎn)速200搖瓶，接種量5%，裝液量50ml/250ml，培養(yǎng)時間6天。
[0026](3)提取步驟(2)中的發(fā)酵產(chǎn)物，提取方法為:取25ml發(fā)酵液，以轉(zhuǎn)速15000rpm離心旋轉(zhuǎn)15min，棄上清，加入1ml蒸飽水吹打清洗殘留甘油，在零下20°C冷凍30min后低溫真空干燥12h，加入甲醇5ml靜置過夜萃取，取上清Iml以轉(zhuǎn)速15000rpm離心15min后過濾有機(jī)F膜，將得到的產(chǎn)物在高效液相儀中檢測，其中流動相為甲醇/ 二氯甲烷(4:1)。參見圖2，黃桿菌MK4產(chǎn)量(0.45mg/L)相比較附圖1中的原始菌MK4產(chǎn)量(0.21mg/L)有所提高，維生素K2總產(chǎn)量提高114%。
[0027]實(shí)施例二
[0028]本實(shí)例包括以下步驟:
[0029](I)以黃桿菌(CCTCC AB 2010137)為出發(fā)菌，將黃桿菌接種于液體培養(yǎng)基中活化，液體培養(yǎng)基成分為:甘油25g/L、葡萄糖5g/L、魚粉蛋白胨15g/L、酵母浸膏2g/L、K2HP044.8g/L、NaC13.5g/L、MgSO4.7H20 0.4g/L，在 ΡΗ7.0、培養(yǎng)溫度 30°C 條件下，培養(yǎng) 2 天。
[0030](2)將步驟(I)獲得的黃桿菌菌株活化種子懸液接入含有胡蘿卜渣粉和綠茶渣粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，該發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:甘油10g/L，麥芽糖10g/L，魚粉蛋白胨5g/L，酵母浸膏 1.0g/L，K2HPO4 4.0g/L，NaCl 3.5g/L，MgSO4.7H20 0.2g/L，胡蘿卜渣粉 10g/L，綠茶渣粉0.5g/L，PH7.0，培養(yǎng)溫度35°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200，接種量3%，裝液量50ml/250ml，培養(yǎng)時間6天。
[0031](3)提取步驟(2)中的發(fā)酵產(chǎn)物，提取方法為:取25ml發(fā)酵