發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001](—)
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及γ-氨基丁酸，具體涉及發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸。
[0002](二)
【背景技術(shù)】
γ -氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它是一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，具有極其重要的生理功能，它能促進(jìn)腦的活化性，健腦益智，抗癲癇，促進(jìn)睡目民，美容潤(rùn)膚，延緩腦衰老機(jī)能，能補(bǔ)充人體抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有良好的降血壓功效。促進(jìn)腎機(jī)能改善和保護(hù)作用。抑制脂肪肝及肥胖癥，活化肝功能。每日補(bǔ)充微量的伽瑪氨基丁酸有利于心腦血壓的緩解，又能促進(jìn)人體內(nèi)氨基酸代謝的平衡，調(diào)節(jié)免疫功能。γ-氨基丁酸屬?gòu)?qiáng)神經(jīng)抑制性氨基酸，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、降血壓的生理作用。它是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(Inhibitory Neurotransmitter)，可以抑制動(dòng)物的活動(dòng)，減少能量的消耗。
[0003]γ -氨基丁酸的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法兩種。
[0004]化學(xué)合成法多見(jiàn)于專利文獻(xiàn)的報(bào)道，成本較高，得率較低，并且在生產(chǎn)工藝中使用危險(xiǎn)溶劑，甚至是有毒溶劑。因此化學(xué)合成法制備的γ-氨基丁酸不能用于食品，也不能被認(rèn)為是一種天然食品添加劑。
[0005]生物合成法相比較來(lái)說(shuō)是一種既安全、又低成本的方法。在早期的研宄中，發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸以大腸桿菌為生產(chǎn)菌，發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮水解液、玉米漿、蛋白胨、礦物質(zhì)等。在發(fā)酵過(guò)程中，利用大腸桿菌脫羧酶的作用，將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸，再分離純化得到GABA制品。但是，若要進(jìn)行食品開發(fā)，使用大腸桿菌無(wú)疑存在安全性方面的種種問(wèn)題。根據(jù)最新的研宄報(bào)道和專利文獻(xiàn)，乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等一些安全性高的微生物在γ-氨基丁酸類食品的制備中已有應(yīng)用，這就使得生物合成的γ-氨基丁酸制品能用作高檔功能性保健食品的配料。
[0006]2013年09月18，公布的一種利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，公開了一種枯草芽孢桿菌(菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，保藏日期為2011年12月08號(hào)，菌種保藏編號(hào)為CGMCC N0.5550，菌種分類命名為枯草芽孢桿菌，英文名稱為Bacillus subtilis)。通過(guò)微生物(枯草芽孢桿菌)發(fā)酵法生產(chǎn)γ -氨基丁酸，γ -氨基丁酸含量不低于55%。
[0007]但是上述發(fā)酵法生產(chǎn)γ -氨基丁酸，周期均過(guò)長(zhǎng)，嚴(yán)重影響對(duì)γ -氨基丁酸供應(yīng)，需要改進(jìn)。
[0008](三)

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸，操作方便，過(guò)程易于控制，反應(yīng)時(shí)間短，產(chǎn)物純度高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸，其特殊之處在于:包括以下步驟:
(O種子培養(yǎng)
枯草芽孢桿菌的平板培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，1.5%瓊脂粉，pH 7.0,
枯草芽孢桿菌的種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L, pH 7.0，121 °C下滅菌20 min，培養(yǎng)溫度為37°C，
從平板上挑取一單菌落，接種至裝有150 ml種子培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，于搖床上200 rpm 37 °C振搖培養(yǎng)14 h ；
(2)枯草芽孢桿菌的分批發(fā)酵
將種子以0.5%接種量接種至3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉 5g/L，氯化鈣 0.1 g/L, Zn2+0.08-0.1 g/L，F(xiàn)eCl3 0.1-0.4g/L，pH 自然，在轉(zhuǎn)速600rpm，通氣量1.0 vvm，35-37 °C，培養(yǎng)0.4_2h后，發(fā)酵結(jié)束；
(3)催化反應(yīng):
發(fā)酵結(jié)束后，于發(fā)酵液中直接投加w/v為60-65%的L-谷氨酸，調(diào)節(jié)pH為4.5?4.8進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)條件為30-35°C催化0.5-2h;
(4)脫色、提純:催化液在發(fā)酵罐中升溫至121°C滅菌30min，滅菌結(jié)束后通過(guò)發(fā)酵罐夾套循環(huán)水冷卻至常溫，處理液按照10%添加量添加孔徑小于30nm的活性炭，90°C處理20min以進(jìn)行脫色，將脫色液流過(guò)孔徑0.2μπι的陶瓷微濾膜，控制膜管壓力在0_0.3MPa之間，流速65L/h，收集的濾液通過(guò)管道流入裝有截留分子量300道爾頓以下的高分子納濾膜的膜管中，控制膜管壓力在0-1.5MPa之間，流速為240L/h，收集流出液通過(guò)管道流入裝有截留分子量100道爾頓以下的高分子納濾膜的膜管中，控制膜管壓力在0-1.5MPa之間，流速為250L/h，棄流出液，待濃縮液體積濃縮至15-19L時(shí)，停止?jié)饪s，得濃縮液，向濃縮液中加入3倍體積95%的乙醇，4°C靜置0.8-1.5h，過(guò)濾收集晶體，再按10ml/g比例加入95%乙醇，40°C攪拌lOmin，過(guò)濾收集晶體；將收集的晶體100°C沸騰干燥20min，得到γ -氨基丁酸成品。
[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明用于生產(chǎn)乳果低聚糖操作簡(jiǎn)單、作用條件溫和、易掌握，γ-氨基丁酸制備過(guò)程中催化液總回收率為95.7-96.4%，產(chǎn)物純度為99.3%，生產(chǎn)周期短，大大提高了發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的產(chǎn)量，是發(fā)酵工藝中的重大的創(chuàng)新，值得推廣。
[0011](四)【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1
本實(shí)施例發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸，包括以下步驟:
(O種子培養(yǎng)
枯草芽孢桿菌的平板培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，1.5%瓊脂粉，PH 7.0,
枯草芽孢桿菌的種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L, pH 7.0，121 °C下滅菌20 min，培養(yǎng)溫度為37°C，
從平板上挑取一單菌落，接種至裝有150 ml種子培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，于搖床上200 rpm 37 °C振搖培養(yǎng)14 h ；
(2)枯草芽孢桿菌的分批發(fā)酵
將種子以0.5%接種量接種至3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化鈉 5g/L，氯化鈣 0.lg/L，Zn2+0.08g/L，F(xiàn)eCl3 0.28g/L，pH 自然，在轉(zhuǎn)速600rpm，通氣量1.0 vvm，37°C，培養(yǎng)0.4h后，發(fā)酵結(jié)束；
(3)催化反應(yīng):
發(fā)酵結(jié)束后，于發(fā)酵液中直接投加w/v為60%的L-谷氨酸，調(diào)節(jié)pH為4.5?4.8進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)條件為30°C催化2h;
(4)脫色、提純:催化液在發(fā)酵罐中升溫至121°C滅菌30min，滅菌結(jié)束后通過(guò)發(fā)酵罐夾套循環(huán)水冷卻至常溫，處理液按照10%添加量添加孔徑小于30nm的活性炭，90°C處理20min以進(jìn)行脫色，將脫色液流過(guò)孔徑0.2μπι的陶瓷微濾膜，控制膜管壓力在0_0.3MPa之間，流速65L/h，收集的濾液通過(guò)管道流入裝有截留分子量300道爾頓以下的高分子納濾膜的膜管中，控制膜管壓力在0-1.5MPa之間，流速為240L/h，收集流出液通過(guò)管道流入裝有截留分子量100道爾頓以下的高分子納濾膜的膜管中，控制膜管壓力在0-1.5MPa之間，流速為250L/h，棄流出液，待濃縮液體積濃縮至15L時(shí)，停止?jié)饪s，得濃縮液，向濃縮液中加入3倍體積95%的乙醇，4°C靜置0.8h，過(guò)濾收集晶體，再按10ml/g比例加入95%乙醇，40°C攪拌lOmin，過(guò)濾收集晶體；將收集的晶體100°C沸騰干燥20min，得到γ-氨基丁酸成品。
[0012]實(shí)施例2
本實(shí)施例發(fā)酵法生