一種有效改善重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種有效改善外源蛋白在大腸桿菌宿主中可溶性表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前基因工程中最常用的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng).具有生長周期短、方法簡便、構(gòu)建快捷、表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，但由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)存在的缺陷，使所表達(dá)的蛋白常常易形成不溶性、無生物活性的包涵體。盡管可以通過后期變復(fù)性操作來獲得蛋白的可溶性，過程復(fù)雜且收率低，顯著增加了蛋白純化的成本。為了獲得有生物活性的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物，已有相關(guān)學(xué)者或研究人員摸索了許多方法來提高重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，提供了分子伴侶蛋白質(zhì)、二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶等共表達(dá)方法或借助于金黃色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫還原蛋白等融合標(biāo)簽可溶性表達(dá)或借助培養(yǎng)條件改變?nèi)缃档驼T導(dǎo)溫度等方法，并已在生物工程、基因工程或分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等轉(zhuǎn)基因表達(dá)中獲得了大量應(yīng)用，但對(duì)于一些蛋白而言，仍存在著過程復(fù)雜、操作繁瑣、后期純化成本高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供了一種簡單有效、可防止包涵體產(chǎn)物形成的方法，能夠豐富和增強(qiáng)研究人員提高外源基因可溶性表達(dá)的手段，具有操作簡便、生產(chǎn)成本低以及可規(guī)模放大的特點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
O種子活化:將-80°C凍存的重組蛋白大腸桿菌工程菌在無菌環(huán)境下按照0.1%的接種量及根據(jù)具體的宿主及載體情況加入相應(yīng)量的抗生素，于36?38°C LB或其他培養(yǎng)基中150?220rpm搖床中培養(yǎng)過夜或12?14h。
[0005]2)發(fā)酵罐接種:在火焰保護(hù)下，按照I?10%的接種量接入種子液及加入相應(yīng)量的抗生素進(jìn)行菌體繁殖培養(yǎng)，溫度32?38°C，pH控制在6.5?7.5，飽和溶氧濃度控制在10?50%。在后期可通過流加補(bǔ)料方式來延長發(fā)酵周期及提高菌體生長量。
[0006]3)誘導(dǎo)表達(dá):當(dāng)快要達(dá)到誘導(dǎo)階段時(shí)，間斷補(bǔ)料持續(xù)10?30分鐘，通過含量測定確定培養(yǎng)基中C、N、P中的一種或數(shù)種限制性營養(yǎng)源消耗殆盡或低于控制水平之下時(shí)，開始進(jìn)行溫度變化或誘導(dǎo)劑添加等方式進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。后續(xù)通過控制營養(yǎng)源與其他補(bǔ)料成分分開流加的方式進(jìn)行補(bǔ)料。此階段維持2?36小時(shí)。注意其他營養(yǎng)源應(yīng)按照菌體營養(yǎng)需求正常流加，中間可通過過程含量測定來改進(jìn)配方。
[0007]4)收獲菌體:5000 rpm離心5?20 min,去除上清，收集菌體，置于-20°C保存。
[0008]本方法主要通過后期控制與蛋白合成有關(guān)的營養(yǎng)源補(bǔ)料流加的方式來減慢蛋白合成的速度，從而改善重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。
[0009]所述誘導(dǎo)表達(dá)階段的補(bǔ)料可為合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、復(fù)合培養(yǎng)基，優(yōu)選為全合成培養(yǎng)基，必要時(shí)可加入微量元素進(jìn)行補(bǔ)充，如為半合成培養(yǎng)基、復(fù)合培養(yǎng)基，其天然有機(jī)物中所含的限制性營養(yǎng)源應(yīng)注意在內(nèi)。
[0010]所述誘導(dǎo)表達(dá)階段的補(bǔ)料應(yīng)與菌體生長階段補(bǔ)料應(yīng)間斷一段時(shí)間，促使培養(yǎng)基中的限制性營養(yǎng)源耗盡或低于后期控制水平以下，間隔時(shí)間優(yōu)選為10?30分鐘，優(yōu)選為采用含量檢測來控制。
[0011]所述改善重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)體系中可溶性表達(dá)的方法，可與其他已知的改善可溶性表達(dá)的方法如融合標(biāo)簽、分子伴侶以及培養(yǎng)條件改變等組合使用。
【具體實(shí)施方式】
[0012]結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說明。
[0013]實(shí)施例1
菌株:E.coli ILlO BL21(DE3)PET15b 工程菌(自主購建)；
培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基
搖瓶配制:按照LB配方(氯化鈉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L)，將各種試劑稱好后，加入相應(yīng)量的三級(jí)水，使其溶解并調(diào)節(jié)PH至7.0，分裝搖瓶50ml /瓶(250ml)，在高壓滅菌鍋內(nèi)121° C20min滅菌。
[0014]1L發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照6L量根據(jù)LB配方稱好各種試劑，加入相應(yīng)量的三級(jí)水，加入發(fā)酵罐中，并采取在線滅菌的方式于121° C 20min滅菌后降溫至37 °C備用。
[0015]菌體生長階段補(bǔ)料配制:按照胰蛋白胨50 g/L，酵母浸粉25 g/L配制I升，混合后在高壓滅菌鍋內(nèi)121° C20min滅菌后備用。
[0016]菌體誘導(dǎo)表達(dá)階段補(bǔ)料配制:按照葡萄糖100 g/L，配制500ml，硝酸銨50 g/L、3水磷酸氫二鉀14 8/1，磷酸二氫鉀5.2 g/L，混合配制500ml，在高壓滅菌鍋內(nèi)121° C20min滅菌后備用。
[0017]一級(jí)種子制備:將-80° C凍存的重組蛋白大腸桿菌工程菌在無菌環(huán)境下按照0.1%的接種量及終濃度50ug/ml的卡那霉素，于LB培養(yǎng)基中37°C，200rpm培養(yǎng)過夜。
[0018]發(fā)酵罐接種及菌體生長:在火焰保護(hù)下，按5%的量加入300ml制備的種子及終濃度為50ug/ml的卡那霉素，在線采用質(zhì)量百分比20%的氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后在37°C，pH為7.0，溶氧控制在30%左右的飽和溶氧濃度，進(jìn)行菌體生長培養(yǎng)。當(dāng)溶氧升至50%后，則需流加補(bǔ)料。
[0019]對(duì)照樣誘導(dǎo)表達(dá):當(dāng)菌體密度0D600達(dá)到時(shí)22時(shí)，直接加入終濃度為0.2mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，補(bǔ)料配方及流加控制如生長階段，誘導(dǎo)10小時(shí)后取樣5000 rpm離心10 min作為對(duì)照樣。
[0020]本發(fā)明方法誘導(dǎo)表達(dá):當(dāng)菌體密度0D600達(dá)到時(shí)22時(shí)，停止流加補(bǔ)料，繼續(xù)培養(yǎng)30min后，取樣測定發(fā)酵液中還原糖含量，余樣作誘導(dǎo)前空白樣，當(dāng)還原糖低至0.05%時(shí)，力口入終濃度為0.2mM誘導(dǎo)劑IPTG，流加葡萄糖，控制還原糖濃度在0.1%左右。期間每間隔30min流加30ml/次混合非C源補(bǔ)料。誘導(dǎo)10小時(shí)后結(jié)束。
[0021]收獲菌體:5000 rpm離心10 min,收集菌體。
[0022]樣品處理與檢測:稱取2.5g各個(gè)樣品菌體加入10ml 20 mM Tris-HCl, pH8.0破菌緩沖液，攪拌10?20 min使之混合均勻，超聲破碎在400W功率下，采取超聲條件總時(shí)間10分鐘，開啟2秒，關(guān)閉2秒破碎菌體。完畢后在破菌液中取出20ul作為全蛋白樣品，剩余破菌液于4°C，12000rpm下離心1min,作為可溶性蛋白樣品，經(jīng)過處理后進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)，通過bandscan軟件掃描，由結(jié)果可知，重組蛋白可溶性表達(dá)比對(duì)照樣提高了 50%。
[0023]實(shí)施例2
菌株:E.coli ILlO BL21(DE3)PET15b工程菌(本公司自主購建);
培養(yǎng)基:2YT液體培養(yǎng)基(氯化鈉5g/L，蛋白胨16g/L，酵母浸粉10g/L)
搖瓶配制:按照2YT配方，將各種試劑稱好后，加入相應(yīng)量的三級(jí)水，使其溶解并調(diào)節(jié)PH至7.0，分裝搖瓶50ml /瓶(250ml)，在高壓滅菌鍋內(nèi)121° C 20min滅菌。
[0024]1L發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照6L量根據(jù)2YT配方稱好各種試劑，采用三級(jí)水定容至6L，加入發(fā)酵罐中，并采取在線滅菌的方式于121° C 20min滅菌后降溫至37 °C備用。
[0025]菌體生長階段補(bǔ)料配制:按照胰蛋白胨50 g/L，酵母浸粉25 g/L配制I升，混合后在高壓滅菌鍋內(nèi)121° C20min滅菌后備用。
[0026]菌體誘導(dǎo)表達(dá)階段補(bǔ)料配制:按照硝酸銨100 g/L,配制500ml，葡萄糖100 g/L、3水磷酸氫二鉀14 8/1，磷酸二氫鉀5.2 g/L，混合配制500ml，在高壓滅菌鍋內(nèi)121° C20min滅菌后備用。
[0027]—級(jí)種子制備:將-80° C凍存的重組蛋白大腸桿菌工程菌在無菌環(huán)境下按照0.1%的接種量及終濃度50ug/ml的卡那霉素，于LB培養(yǎng)基中37°C，200rpm培養(yǎng)過夜。
[0028]發(fā)酵罐接種及菌體生長:在火焰保護(hù)下，按5%的量加入300ml制備的種子及終濃度為50ug/ml的卡那霉素，在線采用質(zhì)量百分比20%的氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后在37°C，pH為7.0，溶氧控制在30%左右的飽和溶氧濃度，進(jìn)行菌體生長培養(yǎng)。當(dāng)溶氧升至50%后，則需流加補(bǔ)料。
[0029]對(duì)照樣誘導(dǎo)表達(dá):當(dāng)菌體密度0D600達(dá)到時(shí)22時(shí)，直接加入終濃度為0.2mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，補(bǔ)料配方及流加控制如生長階段，誘導(dǎo)6小時(shí)后取樣5000 rpm離心10 min作為對(duì)照樣。
[0030]本發(fā)明方法誘導(dǎo)表達(dá):當(dāng)菌體密度0D600達(dá)到時(shí)22時(shí)，停止流加補(bǔ)料，繼續(xù)培養(yǎng)20min后，取樣測定發(fā)酵液中氨基氮含量，余樣作誘導(dǎo)前空白樣，當(dāng)氨基氮含量低至1%時(shí)，加入終濃度為0.2mM IPTG誘導(dǎo)，流加硝酸銨，控制氨基氮濃度在1%左右。期間每間隔30min流加30ml/次混合非N源補(bǔ)料。誘導(dǎo)6小時(shí)后結(jié)束。
[0031]收獲菌體:5000 rpm離心10 min,收集菌體。
[0032]樣品處理與檢測:稱取2.5g各個(gè)樣品菌體加入10ml 20 mM Tris-HCl, pH8.0破菌緩沖液，攪拌10?20 min使之混合均勻，超聲破碎在400W功率下，采取超聲條件總時(shí)間10分鐘，開啟2秒，關(guān)閉2秒破碎菌體。完畢后在破菌液中取出20ul作為全蛋白樣品，剩余破菌液于4°C，12000rpm下離心1min,作為可溶性蛋白樣品，經(jīng)過處理后進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)，通過bandscan軟件掃描，由結(jié)果可知，重組蛋白可溶性表達(dá)樣比對(duì)照提高了 30%。
[0033]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種有效改善重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法，其特征在于:大腸桿菌誘導(dǎo)后，通過后期補(bǔ)料中C、N、P營養(yǎng)源中一種或數(shù)種的供給來控制降低蛋白的合成速度，增加蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)折疊的時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)改善蛋白可溶性表達(dá)的目的。
2.一種有效改善重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法，其特征在于:在大腸桿菌高密度發(fā)酵時(shí)菌體增殖與蛋白誘導(dǎo)表達(dá)之間存在一個(gè)明顯的補(bǔ)料供給間斷期，以消耗完前期供給的豐富養(yǎng)份，從而過渡到后期營養(yǎng)可控的誘導(dǎo)表達(dá)補(bǔ)料供給階段。
3.一種有效改善重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法，其特征在于:此種方法可與其他公知的低溫誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性標(biāo)簽融合表達(dá)、分子伴侶共表達(dá)及培養(yǎng)基中后間添加一些可促進(jìn)蛋白可溶性成份(如酒精、山梨醇等)的方法等一起組合使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，后期補(bǔ)料中C、N、P營養(yǎng)源可以是合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基成分，優(yōu)選為合成培養(yǎng)基成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求2，補(bǔ)料供給間期的長短，可通過飽和溶氧濃度變化情況及限制營養(yǎng)源含量檢測方式來判定，優(yōu)選為限制營養(yǎng)源含量檢測方式。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種有效改善重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法，其特點(diǎn)主要在于1.通過后期控制補(bǔ)料C、N、P營養(yǎng)源的供給速度來控制蛋白的合成速度。2.在菌體增殖與蛋白誘導(dǎo)表達(dá)階段之間存在有一個(gè)明顯補(bǔ)料間斷期。3.可與蛋白低溫表達(dá)、分子標(biāo)侶共表達(dá)、標(biāo)簽融合表達(dá)等公知的提高重組蛋白可溶性表達(dá)的方法進(jìn)行組合使用。此方法適用于生物工程、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及基因工程等相關(guān)異源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的研究，能顯著提高重組蛋白的可溶性表達(dá)。
【IPC分類】C12P21-02, C12R1-19
【公開號(hào)】CN104561200
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310517277
【發(fā)明人】魏國祥, 楊雪寧, 鄭春陽
【申請(qǐng)人】天津強(qiáng)微特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月29日