一種制備枸杞ace抑制肽的方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明屬于ACE抑制肽制備方法，特別涉及一種制備枸杞ACE抑制肽的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】： 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzy me,簡稱ACE)是使血壓升高的一 個(gè)關(guān)鍵酶。一方面，它可催化不具有活性的血管緊張素 I轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈收縮血管作用的 血管緊張素 II ;另一方面，它能降解具有舒張血管作用的舒緩激肽并導(dǎo)致其失活。因此，通 過抑制ACE的活性就可達(dá)到預(yù)防和治療高血壓的目的。已知通過對(duì)多種來源的蛋白進(jìn)行蛋 白水解消化可獲得ACE抑制肽，該蛋白的來源包括魚、動(dòng)物奶蛋白以及植物。多數(shù)所描述的 用于從植物蛋白中獲得ACE抑制肽的方法在水解之前均包括對(duì)所述蛋白進(jìn)行初步純化的 步驟,其增加了所述方法的成本和復(fù)雜性并因此增加了產(chǎn)品的成本。因此,仍需要從植物材 料中制備ACE抑制劑組合物的改進(jìn)方法和高特異活性的ACE抑制肽的其它來源。
[0003] 目前，人們已從食品蛋白質(zhì)中獲得了各種功能性肽，如促鈣吸收肽、ACE抑制肽、免 疫調(diào)節(jié)肽等。ACE抑制肽因其無毒副作用的降壓功能成為活性肽研究的熱點(diǎn)，《食品科技》 2009年第34卷第4期，任清等著《蕎麥蛋白的提取及其酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的研究》中 提到過類似方法，該文中提出以蕎麥粉為原料，采用堿提酸沉法提取蕎麥蛋白。通過正交實(shí) 驗(yàn)優(yōu)化了最佳蛋白提取工藝：溫度50°C，pH=ll，時(shí)間3h，蛋白的提取率可達(dá)44. 2%，由堿性 蛋白酶、中性蛋白酶及復(fù)合蛋白酶共同水解所獲得的產(chǎn)物ACE抑制肽活性可達(dá)90. 55%。
[0004] 枸杞是茄目茄科枸杞屬（Lycium)的植物，果實(shí)稱枸杞子，嫩葉稱枸杞頭，常見種類 為枸杞（Lycium chinense Miller)，主要的藥用種類為寧夏枸杞（Lycium barbarum L·)。 寧夏枸杞是寧夏地區(qū)的五寶之一，其作為名貴的藥材和滋補(bǔ)品，中醫(yī)很早就有"枸杞養(yǎng)生" 的說法，《本草綱目》中有記載："枸杞，補(bǔ)腎生精，養(yǎng)肝……明目安神，令人長壽。"因其具有 降低血糖、抗脂肪肝作用，并能抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥食同源的功效，申請(qǐng)人結(jié)合現(xiàn)有技術(shù) 的研究方法，經(jīng)過分析對(duì)比，建立從枸杞中提取ACE抑制肽的方法并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，最終測(cè) 得ACE抑制肽的活性。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的是提供一種制備枸杞ACE抑制肽的方法，即建立從枸杞中提取ACE抑制 肽的方法并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，并對(duì)其進(jìn)行ACE抑制肽的活性測(cè)定。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案： 一種制備枸杞ACE抑制肽的方法，是以枸杞為原料，經(jīng)研磨成粉加超純水成枸杞溶液， 進(jìn)行離心處理后得枸杞粗蛋白，然后加超純水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解 制得枸杞ACE抑制肽，包括以下步驟： 51 :將枸杞研磨成枸杞粉，過80目篩網(wǎng)，并稱取枸杞粉于燒杯中，按1:80的質(zhì)量比加 入超純水，攪拌至完全溶解，然后用質(zhì)量體積比為20%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5得枸杞溶 液； 52 :將上述枸杞溶液在40°C條件下水浴攪拌4h后，于4°C，6000r/min條件下離心處 理，取上清液，用lmol/L HCl溶液調(diào)解等電點(diǎn)至pH=4. 0,靜置； 53 :在4°C，6000r/min條件下離心，棄上清液，取沉淀，并將沉淀沖洗至中性，將沉淀放 置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白； 54 :取上述干燥后的枸杞粗蛋白，按1:20的質(zhì)量比加入超純水配置成5%的枸杞蛋白溶 液，然后加入中性蛋白酶，在溫度45°C，pH=7條件下連續(xù)酶解4h，然后迅速冷卻至40°C，調(diào) 節(jié)pH至枸杞蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH=4 ; 55 :將上述酶解處理后的枸杞蛋白溶液在4°C，6000r/min條件下離心處理，并取上清 液，即得枸杞ACE抑制肽。
[0007] S6 :用N-(3-[2-呋喃]丙烯酰）-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG)作為ACE 抑制肽的底物，測(cè)定4個(gè)時(shí)間段肽組分的抑制肽活性。
[0008] 上述加入的中性蛋白酶與枸杞蛋白的質(zhì)量比為1:50。
[0009] 上述連續(xù)酶解過程是每隔Ih取酶解液20ml，于90°C水浴中進(jìn)行滅酶15min。
[0010] 上述測(cè)定枸杞ACE抑制肽的活性是在酶標(biāo)定量儀中340nm波長條件下，先測(cè)出空 白孔、樣品孔的初始吸光度，然后在37°C環(huán)境下孵育30min后再一次測(cè)定吸光度，根據(jù)I= (空白吸光度減少值-樣品吸光度減少值）/空白吸光度減少值，算出其抑制率。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：采用本發(fā)明的方法制備的枸杞ACE抑制肽活性強(qiáng)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè) 定其活性可達(dá)99. 03%，能夠有效地起到降壓作用，可同時(shí)發(fā)揮出營養(yǎng)和保健兩方面的作用， 因此，有望為開發(fā)無毒副作用的降壓功能新藥物提供有效成分。
[0012]
【具體實(shí)施方式】： 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
[0013] 實(shí)施例1 將枸杞研磨成粉，過80目篩，稱取50g于燒杯，加入400ml超純水，攪拌至完全溶解得 枸杞溶液；用質(zhì)量體積比為20%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5,在40°C條件下水浴攪拌4h后， 在4°C，6000r/min條件下離心，取上清液，用lmol/L HCl溶液調(diào)解等電點(diǎn)至pH=4. 0,靜置； 在4°C，6000r/min條件下離心，棄上清液，取沉淀，并將沉淀沖洗至中性，將沉淀放置在真 空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取5g干燥后的枸杞粗蛋白，用超純水配置成5%的枸 杞蛋白溶液l〇〇g，根據(jù)加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0. lg，在溫度45°C， pH=7條件下連續(xù)酶解4小時(shí)，每隔Ih取酶解液20ml，90°C水浴15min滅酶，迅速冷卻至 4(TC，調(diào)節(jié)pH至枸杞蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH=4 ;在4-C，6000r/min條件下離心并取上清液即得枸 杞ACE抑制肽。
[0014] 實(shí)施例2 將枸杞研磨成粉，過80目篩，稱取25g于燒杯，加入200ml超純水，攪拌至完全溶解得 枸杞溶液；用質(zhì)量體積比為20%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5,在40°C條件下水浴攪拌4h后， 在4°C，6000r/min條件下離心，取上清液，用lmol/L HCl溶液調(diào)解等電點(diǎn)至pH=4. 0,靜置； 在4°C，6000r/min條件下離心，棄上清液，取沉淀，并將沉淀沖洗至中性，將沉淀放置在真 空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取2. 5g干燥后的枸杞粗蛋白，用超純水配置成5% 的枸杞蛋白溶液50g，根據(jù)加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0.05g，在溫度 45°C，pH=7條件下連續(xù)酶解4小時(shí)，每隔Ih取酶解液20ml，90°C水浴15min滅酶，迅速冷卻 至4(TC，調(diào)節(jié)pH至枸杞蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH=4 ;在4?，6000r/min條件下離心并取上清液即得 枸杞ACE抑制肽。
[0015] 實(shí)施例3 將枸杞研磨成粉，過80目篩，稱取IOOg于燒杯，加入800ml超純水，攪拌至完全溶解 得枸杞溶液；用質(zhì)量體積比為20%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5,在40°C條件下水浴攪拌4h 后，在4°C，6000r/min條件下離心，取上清液，用lmol/L HCl溶液調(diào)解等電點(diǎn)至pH=4.0,靜 置；在4°C，6000r/min條件下離心，棄上清液，取沉淀，并將沉淀沖洗至中性，將沉淀放置在 真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取IOg干燥后的枸杞粗蛋白，用超純水配置成5% 的枸杞蛋白溶液200g，根據(jù)加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0. 2g，在溫度 45°C，pH=7條件下連續(xù)酶解4小時(shí)，每隔Ih取酶解液20ml，90°C水浴15min滅酶，迅速冷卻 至4(TC，調(diào)節(jié)pH至枸杞蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH=4 ;在4?，6000r/min條件下離心并取上清液即得 枸杞ACE抑制肽。
[0016] 測(cè)定采用上述方法制備的枸杞ACE抑制肽的活性，在酶標(biāo)定量儀中340nm波長條 件下，先測(cè)出空白孔、樣品孔的初始吸光度，然后在37°C環(huán)境下孵育30min后再一次測(cè)定 吸光度，根據(jù)I=(空白吸光度減少值-樣品吸光度減少值）/空白吸光度減少值，算出其抑 制率。其中，枸杞ACE抑制肽的活性測(cè)定受到時(shí)間，底物濃度和加酶量三個(gè)因素的影響，用 N-(3-[2-呋喃]丙烯酰）-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG)作為ACE抑制肽的底物， 對(duì)此選用L9 (33)正交設(shè)計(jì)表對(duì)上述時(shí)間，底物濃度和加酶量三個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，建立 從枸杞中提取ACE抑制肽的方法并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，各因素及水平的設(shè)計(jì)見表1 : 表I L9 (33)正交實(shí)驗(yàn)因素水平
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：以枸杞為原料，經(jīng)研磨成粉加超純水 成枸杞溶液，進(jìn)行離心處理后得枸杞粗蛋白，然后加超純水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋 白酶進(jìn)行酶解制得枸杞ACE抑制肽，包括以下步驟： 51 :將枸杞研磨成枸杞粉，過80目篩網(wǎng)，并稱取枸杞粉于燒杯中，按1:80的質(zhì)量比加 入超純水，攪拌至完全溶解，然后用質(zhì)量體積比為20%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5得枸杞溶 液； 52 :將上述枸杞溶液在40°C條件下水浴攪拌4h后，于4°C，6000r/min條件下離心處 理，取上清液，用lmol/L HCl溶液調(diào)解等電點(diǎn)至pH=4. 0,靜置； 53 :在4°C，6000r/min條件下離心，棄上清液，取沉淀，并將沉淀沖洗至中性，將沉淀放 置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白； 54 :取上述干燥后的枸杞粗蛋白，按1:20的質(zhì)量比加入超純水配置成5%的枸杞蛋白溶 液，然后加入中性蛋白酶，在溫度45°C，pH=7條件下連續(xù)酶解4h，然后迅速冷卻至40°C，調(diào) 節(jié)pH至枸杞蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH=4 ; 55 :將上述酶解處理后的枸杞蛋白溶液在4°C，6000r/min條件下離心處理，并取上清 液，即得枸杞ACE抑制肽； 56 :用N-(3-[2-呋喃]丙烯酰）-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG)作為ACE抑 制肽的底物，測(cè)定4個(gè)時(shí)間段肽組分的抑制肽活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述加入的 中性蛋白酶與枸杞蛋白的質(zhì)量比為1:50。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述連續(xù)酶 解過程是每隔Ih取酶解液20ml，于90°C水浴中進(jìn)行滅酶15min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述測(cè)定枸 杞ACE抑制肽的活性是在酶標(biāo)定量儀中340nm波長條件下，先測(cè)出空白孔、樣品孔的初始吸 光度，然后在37°C環(huán)境下孵育30min后再一次測(cè)定吸光度，根據(jù)1=(空白吸光度減少值-樣 品吸光度減少值）/空白吸光度減少值，算出其抑制率。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種制備枸杞ACE抑制肽的方法，其是以枸杞為原料，經(jīng)研磨成粉加超純水成枸杞溶液，進(jìn)行離心處理后得枸杞粗蛋白，然后加超純水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解制得枸杞ACE抑制肽，并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件及對(duì)其進(jìn)行ACE抑制肽的活性測(cè)定。采用本發(fā)明的方法制備的枸杞ACE抑制肽活性強(qiáng)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定其活性可達(dá)99.03%，能夠有效地起到降壓作用，可同時(shí)發(fā)揮出營養(yǎng)和保健兩方面的作用，因此，有望為開發(fā)無毒副作用的降壓功能新藥物提供有效成分。
【IPC分類】C12P21-06
【公開號(hào)】CN104561205
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410824684
【發(fā)明人】楊建軍, 陳琨, 趙俊香
【申請(qǐng)人】寧夏醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月27日