一種通過微生物轉(zhuǎn)化來制備4-雄烯二酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過微生物轉(zhuǎn)化來制備4-雄烯二酮的方法，尤其涉及4-雄烯二 酮制備過程中的串罐發(fā)酵技術(shù)，即在利用分支桿菌選擇性降解植物留醇制備4-雄烯二酮 的過程中通過串罐發(fā)酵技術(shù)用微生物三個生長階段持續(xù)降解植物留醇高產(chǎn)4-雄烯二酮的 發(fā)酵工藝，屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 4_雄烯二酮(化學名稱：雄留_4_烯_3,17-二酮，英文名4-Androstenedione，簡 稱AD)，該產(chǎn)品外觀形狀呈近白色晶體粉末，無異味，無毒性，不溶于水，是一種當今世界上 用途極廣，科技含量高的生物化工中間體。
[0003] 雄烯二酮是生產(chǎn)激素類原料藥的重要中間體，可以說幾乎所有留體激素藥物都可 以以雄烯二酮為起始原料進行生產(chǎn)，如用于生產(chǎn)皮質(zhì)激素、性激素、孕激素及蛋白同化激 素，又可用于合成可的松、強的松、黃體酮、雌烯醇、地塞米松等100余種藥物，也是用于生 產(chǎn)抗早孕米非司酮和各類計劃生育用藥必不可少的原料。
[0004] 發(fā)酵法生產(chǎn)4-雄烯二酮是1998年在美國一家制藥公司開始，它以原料來源廣、原 料成本低、反應專一性強、反應條件溫和、生產(chǎn)步驟簡化和生產(chǎn)周期短等優(yōu)點逐漸取代了傳 統(tǒng)的化學合成法，在國內(nèi)外受到了普遍的重視。
[0005] 在微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)4-雄烯二酮的過程中，4-雄烯二酮的產(chǎn)品收率通過提取、精 制技術(shù)的一系列改進進一步提升的空間非常有限，所以目前降低4-雄烯二酮生產(chǎn)成本的 潛力在發(fā)酵技術(shù)的改進方面。如何最大限度地提高微生物對植物留醇的轉(zhuǎn)化率是每個生產(chǎn) 企業(yè)研究的重點。目前，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)4-雄烯二酮都采用單純的間歇式分批培養(yǎng)發(fā) 酵，種子培養(yǎng)需要采用逐級擴大培養(yǎng)的方法，即從斜面到種子罐，經(jīng)過一級和二級種子罐逐 級擴大培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。種子液進入發(fā)酵罐后還要經(jīng)過對環(huán)境的適應期、自身對數(shù)生 長期最后再進入次級代謝期產(chǎn)生目的產(chǎn)物。這種逐級培養(yǎng)方式使得種子液在發(fā)酵罐內(nèi)較長 時間只是進行了自身初級代謝，一般在35~45h才開始進行合成目的產(chǎn)物的次級代謝，并且 4_雄烯二酮轉(zhuǎn)化菌種還沒有對植物留醇轉(zhuǎn)化完就會進入菌體代謝衰退期，這樣就會延長發(fā) 酵罐培養(yǎng)周期，增加動力成本，對植物留醇的轉(zhuǎn)化率一般只能維持在459Γ65%，造成生產(chǎn)的 不穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是打破微生物生長代謝三階段的規(guī)律，確保了 4-雄烯 二酮的制備時間出現(xiàn)在微生物生長代謝的適應期，縮短了整個發(fā)酵周期。
[0007] 微生物轉(zhuǎn)化法是指某種微生物對有機物某一特定部位或基團作用使它轉(zhuǎn)變成結(jié) 構(gòu)上相似的另一種化合物的過程。微生物轉(zhuǎn)化與一般的氨基酸和抗生素發(fā)酵不同，轉(zhuǎn)化產(chǎn) 物不是微生物的代謝產(chǎn)物，而是利用微生物所產(chǎn)生的酶對底物的某一部位進行特定的生物 化學反應來獲得的特定產(chǎn)物。留體類物質(zhì)一般不是微生物代謝途徑中起生理作用的物質(zhì)， 因此，留體類物質(zhì)不像其他營養(yǎng)物質(zhì)一樣，會被微生物最終分解為二氧化碳和水。
[0008] 微生物轉(zhuǎn)化植物留醇的過程可用以下通式表示： 進入 分泌 底物一一一一一一菌體細胞一一一一一一反應產(chǎn)物(胞內(nèi)或胞外） 4_雄烯二酮的發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程通常分兩個階段進行，第一階段是菌體的自身生長階段， 該時期供給菌體豐富的營養(yǎng)，在最適溫度、PH和通氣條件下進行培養(yǎng)，以得到足夠的菌體和 大量高活性的轉(zhuǎn)化酶；第二階段是對植物留醇進行定向轉(zhuǎn)化的階段。研究證明這兩個階段 有一個共同特點：菌體的最適自身生長階段的pH范圍與菌體對植物甾醇轉(zhuǎn)化的最適pH范 圍基本相同，這也是本發(fā)明取得成功的關(guān)鍵所在。
[0009] 串罐發(fā)酵即每個發(fā)酵罐的種子液全部來自前一個發(fā)酵罐的發(fā)酵液。一般取生長旺 盛，剛進入轉(zhuǎn)化期的發(fā)酵液。時間：取發(fā)酵液培養(yǎng)至20-30小時發(fā)酵液作為種子最佳，判斷 標準為發(fā)酵液的PH降至6. 8左右，發(fā)酵單位小于0. 5g/l，鏡檢無雜菌。這樣每一個發(fā)酵罐 的種子液來自發(fā)酵罐中剛進入轉(zhuǎn)化期的種子液，依次類推，進行串罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0010] 本發(fā)明中一種通過微生物轉(zhuǎn)化來制備4-雄烯二酮的方法，即4-雄烯二酮制備過 程中的串罐發(fā)酵工藝，其包括以下步驟： 1)種子制備階段 其中，所采用的菌株為恥垢分支桿菌(Mycobacterium smegmatis) :X --級種子罐培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖：〇. 2~0. 5%、硝酸銨：0. 2~0. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05%、磷酸氫二鉀0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后調(diào)pH至7. 0。
[0011] 一級種子罐培養(yǎng)控制參數(shù)：接種量：8~10%，罐溫：28~30 °C，通氣比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐壓：0· 03?0· 05Mpa，轉(zhuǎn)速：20(T300rpm，周期：30?48 小時。
[0012] 2二級種子罐培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：0. 2、. 5%、硝酸銨：0. 2、. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05%、磷酸氫二鉀0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后調(diào)pH至7. 0。
[0013] 二級種子罐的控制參數(shù)為：接種量：1(Γ15%，罐溫：28~30 °C，通氣比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐壓：0· 03?0· 05Mpa，轉(zhuǎn)速：20(T300rpm，周期：20?30 小時。
[0014] 2)發(fā)酵半串罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：1. (Γ5. 〇%、酵母浸粉：〇. 5~2. 5%、硝酸銨：0. 15~0. 55%、 硫酸鎂：〇· 02?0· 2%、磷酸氫二鉀：0· 1?L 0%、硫酸亞鐵：0· 001?0· 01%、碳酸鈣：0· 1?0· 5%、植 物甾醇：1 ?4%、乳化劑：0· 001 ?05 (v/v) %、消泡劑：0· 03% (v/v)。
[0015] 發(fā)酵罐的控制參數(shù)為：接種量：8?10%，罐溫：28?30°C，通氣比：1:0.2?1.(^_，罐 壓：0· 03?0· 05Mpa，轉(zhuǎn)速：15(T260rpm，用10%濃度氨水溶液控制pH在6. 6?7. 0,用20%濃度 的硝酸銨溶液控制發(fā)酵液中氨氮含量為50-70mg/100ml。取發(fā)酵液培養(yǎng)至20-30小時小部 分發(fā)酵液作為種子最佳，判斷標準為發(fā)酵液的PH降至6. 8左右，發(fā)酵單位小于0. 5g/l，鏡檢 無雜菌。每一個發(fā)酵罐的種子液來自上一個發(fā)酵罐中剛進入轉(zhuǎn)化期的種子液，依次類推，進 行串罐發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵罐培養(yǎng)周期為88~108h。
[0016] 取種時間的選擇：按照傳統(tǒng)的間歇式發(fā)酵理論，隨著種子液在發(fā)酵罐培養(yǎng)時間的 延長，種子首先進入對環(huán)境適應期，再進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)周期大約在20-30小時時菌體 量和轉(zhuǎn)化酶活性基本上達到最大，因此取發(fā)酵培養(yǎng)20-30小時發(fā)酵液作為部分種子最佳。 判斷標準：發(fā)酵液的PH降至6. 8左右，發(fā)酵單位小于0. 5g/l，鏡檢無雜菌。
[0017] 3 )發(fā)酵液有效成分HPLC檢測 色譜條件：色譜柱：Kromasil C18 5Mm 200X4. 6mm，流動相：CH30H:H20 = 80 :20 (v/v)，流速：1. 〇ml/min，檢測波長：242nm。
[0018] 標準曲線的測定： 配制一系列不同濃度的AD標準溶液（50-500μ8/πι1)，分別取各濃度標準溶液的過濾液 2〇μ1注入高效液相色譜儀中，測定其吸收峰面積，然后對濃度（Y)和吸收峰面積（X)進行一 元線性回歸，得到一元線性回歸方程。
[0019] 效價計算方法： 將待測樣品制成合適濃度（50-50(^g/ml)的甲醇溶液，用0.45Mm的微孔濾膜過濾，準 確吸取濾液2〇μ1注入HPLC中，記錄色譜圖，將AD峰面積代入上述的回歸方程中，計算得到 樣品中AD量。
[0020] 4)植物留醇轉(zhuǎn)化率的計算 發(fā)酵完成后，發(fā)酵液經(jīng)甲醇處理后，再用液相色譜定量測出雄烯二酮的含量，然后計算 植物留醇的轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率/%=發(fā)酵液中AD含量*100/ (投料油中留醇含量*0. 66*0. 95)。
[0021] 本發(fā)明的優(yōu)點： 1、 通過本方法使得分支桿菌對植物留醇的轉(zhuǎn)化率與完全用逐級擴大培養(yǎng)成熟的種子 液作為發(fā)酵罐的種子相比其轉(zhuǎn)化率提高20%以上；與完全用前一個發(fā)酵罐的發(fā)酵液作為下 一個發(fā)酵罐的種子相比其轉(zhuǎn)化率提高15%以上； 2、 該發(fā)酵工藝為單相水工藝，通過選用合適的乳化劑很好地解決了留醇在水中溶解度 差的問題，為后續(xù)提取解決了一系列難題，使得4-雄烯二酮的質(zhì)量更加穩(wěn)定。
[0022] 3、運用該工藝消除了由于種子質(zhì)量波動引起的發(fā)酵產(chǎn)量的波動，穩(wěn)定了發(fā)酵生 產(chǎn)； 4、運用該工藝使得發(fā)酵周期由原來的160?170小時縮短為現(xiàn)在的80?108小時，縮 短了罐批運轉(zhuǎn)周期，增加進罐批次，提高了設(shè)備利用率，降低了生產(chǎn)成本，可獲得更大的經(jīng) 濟效益。
【具體實施方式】
[0023] 下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，同時增加對照試驗，但是本 發(fā)明不以具體實施例為限。
[0024] 1、制備材料與方法 1. 1材料 1. 1. 1菌種 菌種來源：DY20120806-102 (山東東藥藥業(yè)股份有限公司） I. 1. 2儀器與分析條件 HPLC :安捷倫-1260,色譜條件：色譜柱---Kromasil C18 5Mm 200 X 4. 6mm 流動相 CH3OH = H2O = 80 :20 (v/v)，流速---1. Oml/min，檢測波長---242nm。試 齊IJ :雄留-4-烯-3, 17-二酮（AD)標準品和甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。含量用外標 峰面積法計算。
[0025] 1. 2對照試驗一(傳統(tǒng)的間歇式發(fā)酵） I. 2. 1培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝 1.2. 1.1種子制備階段 2 -級種子罐培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖：〇. 2、. 5%、硝酸銨：0. 2、. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05%、磷酸氫二鉀0. Of 0. 05%、酵母浸粉：1. (Γ2. 2%，加水定容后調(diào)pH至7. 0。
[0026] 一級種子罐培養(yǎng)控制參數(shù)：接種量：8~10%，罐溫：28~30 °C，通氣比： 1:0. 2?I. Ovvm，罐壓：0· 03?0· 05Mpa，轉(zhuǎn)速：20(T300rpm，周期：30?48 小時。
[0027] :S.二級種子罐培養(yǎng)基配方為：葡萄糖：2、. 5%、硝酸銨：0. 2、. 5%、硫酸鎂： 0. Of 0. 05