一種產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酶微生物的篩選方法，尤其涉及一種從深海淤泥中篩選得到產(chǎn)低溫中性蛋白酶的菌株的方法。
技術(shù)背景
[0002]深海環(huán)境由于終年低溫，存在一個低溫的生態(tài)系統(tǒng)，包括多種低溫動物和微生物。深海低溫微生物經(jīng)過長期的進化適應(yīng)，有著適應(yīng)低溫環(huán)境的特殊結(jié)構(gòu)與代謝機制，他們產(chǎn)生的酶在低溫環(huán)境下有著比中溫酶更高的催化效率，從而能夠大幅度節(jié)約能源，在食品、洗滌劑、化妝品和水產(chǎn)飼料等工業(yè)上，有著較高的開發(fā)利用價值。蛋白酶是目前應(yīng)用最多的一種酶，但所用的基本是中溫酶，其最適酶活溫度在50°C左右，而低溫蛋白酶的最適酶活溫度基本都在40°C以下，而且酶的最適產(chǎn)酶溫度都在25°C左右。世界上也有相關(guān)實驗室從事低溫蛋白酶的研究，目前已從海水、嗜冷的魚類和貝類以及高山、南北極泥土等樣品中分離到產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株。有關(guān)深海微生物資源的勘探和代謝活性物質(zhì)研究，已成為國際上極端微生物研究的熱點之一，我國的一些研究機構(gòu)也積極開展低溫蛋白酶生產(chǎn)菌株的篩選工作。
[0003]微生物篩選時由于采集樣品中的微生物數(shù)量較少，通常通過富集培養(yǎng)增加目標(biāo)微生物的數(shù)量，但富集后樣品中微生物多樣性降低，富集培養(yǎng)效果不一致，呈現(xiàn)極好極壞兩極化狀態(tài)。本發(fā)明中將菌液濃縮，從而增加單位體積內(nèi)微生物數(shù)量，確保篩選效果。同時，在培養(yǎng)基制備時投其所好，將海洋淤泥的上清液滅菌后代替雙蒸水制備培養(yǎng)基，確保菌株的正常生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種成本低、易實施、效果好的從深海淤泥中篩選產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌種的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)制備上清液:將深海淤泥加到質(zhì)量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:10~20，得到第一懸浮液；漏斗過濾后再使用真空抽濾器過濾，得到的上清液經(jīng)121 °C高溫蒸汽滅菌15min ；
(2)制備初篩培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；以質(zhì)量比計，初篩培養(yǎng)基中包括2.0%的干酪素和1.5%的瓊脂，余量為步驟I制備的上清液，pH為7.0 ;斜面培養(yǎng)基中包括1.0%的胰蛋白胨、0.5%的酵母膏、1.0%的NaCl和1.5%的瓊脂，余量為步驟I制備的上清液，pH為7.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基中包括4.0%的麩皮、0.1%的蛋白胨、0.4%的Na2HPO4.12H20和0.03%的KH2PO4，余量為步驟I制備的上清液，pH為7.0 ;
(3)菌液濃縮:將深海淤泥加到質(zhì)量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:5~10，得到第二懸浮液，使用漏斗過濾，得到的上清液置于18~22°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6小時，得到濃縮后的菌液；
(4)菌株初篩:將步驟3濃縮后的菌液加到質(zhì)量百分比為0.85%的無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋法稀釋6次，分別取各稀釋梯度的菌液置于步驟2制備的初篩培養(yǎng)基中，20~25°C下培養(yǎng)24~72小時；挑取透明圈大的菌株，在步驟2中制備的斜面培養(yǎng)基中保存；
(5)菌種復(fù)篩:將初篩得到的菌種按體積比1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°C，200rpm培養(yǎng)48h ;得到的發(fā)酵液在8000r/min冷凍離心機中4°C離心15min,得到上清液即為粗酶液；以干酪素為底物，用福林酚法測定粗酶液酶活，進一步挑選出產(chǎn)酶能力強的菌株。
[0006]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的方法通過對培養(yǎng)基改良，在培養(yǎng)基中添加海洋天然物質(zhì)，對樣品濃縮以增加單位體積微生物含量以及控制篩選條件等途徑，從我國東海海域約600m水深獲得的海洋淤泥中篩選得到產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株，最高粗酶酶活達35.5U/ml ο
【具體實施方式】
[0007]實施例1
初篩培養(yǎng)基制備:將取自深海的游泥1g加到10ml雙蒸水中制成懸浮液,搖勻。先使用漏斗過濾再使用真空抽濾器過濾。將上清液經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15min后替代雙蒸水用于制備培養(yǎng)基。初篩培養(yǎng)基:干酪素2.0%，瓊脂1.5%，pH 7.0。斜面培養(yǎng)基:胰蛋白胨
1.0%，酵母膏0.5%，NaCl 1.0%，瓊脂1.5%，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮4.0%，蛋白胨0.1%，Na2HPO4.12Η200.4%, KH2PO40.03%, ρΗ7.0。
[0008]菌液濃縮:取深海淤泥3g加到15ml 0.85%的生理鹽水中制成懸浮液，搖勻。漏斗過濾得到上清液，將上清液放在直徑15cm培養(yǎng)皿中置于18°C培養(yǎng)箱中6小時，實現(xiàn)菌液濃縮。
[0009]菌種初篩:吸取Iml濃縮后的菌液加到9ml無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋法稀釋(10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6)，分別取各稀釋梯度的菌液200ul移入凝固好的初篩平板中，涂布均勻。于25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h小時，挑取透明圈較大的菌株，在試管斜面上劃線保存。
[0010]菌種復(fù)篩:將初篩得到的菌種按1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°c，200rpm培養(yǎng)48h。發(fā)酵液在8000r/min冷凍離心機中4°C離心15min，得到上清液即為粗酶液。以干酪素為底物，用福林酚法測定粗酶液酶活，進一步挑選出產(chǎn)酶能力強的菌株。經(jīng)此方法篩選，初篩得到36株中性蛋白酶菌株，復(fù)篩得到的低溫中性蛋白酶菌株粗酶液酶活達到35U/ml ο
[0011]實施例2
初篩培養(yǎng)基制備:將取自深海的淤泥1g加到200ml雙蒸水中制成懸浮液，搖勻。先使用漏斗過濾再使用真空抽濾器過濾。將上清液經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15min后替代雙蒸水用于制備培養(yǎng)基。初篩培養(yǎng)基:干酪素2.0%，瓊脂1.5%，pH 7.0。斜面培養(yǎng)基:胰蛋白胨
1.0%，酵母膏0.5%，NaCl 1.0%，瓊脂1.5%，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮4.0%，蛋白胨0.1%，Na2HPO4.12Η200.4%, KH2PO40.03%, ρΗ7.0。
[0012]菌液濃縮:取深海淤泥5g加到50ml 0.85%的生理鹽水中制成懸浮液，搖勻，漏斗過濾得到上清液，將上清液放在直徑15cm培養(yǎng)皿中置于22°C培養(yǎng)箱中4小時，實現(xiàn)菌液濃縮。
[0013]菌種初篩:吸取Iml濃縮后的菌液加到9ml無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋法稀釋(10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6)，分別取各稀釋梯度的菌液200ul移入凝固好的初篩平板中，涂布均勻。于25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h小時，挑取透明圈較大的菌株，在試管斜面上劃線保存。
[0014]菌種復(fù)篩:將初篩得到的菌種按1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°C，200rpm培養(yǎng)48h。發(fā)酵液在8000r/min冷凍離心機中4°C離心15min，得到上清液即為粗酶液。以干酪素為底物，用福林酚法測定粗酶液酶活，進一步挑選出產(chǎn)酶能力強的菌株。經(jīng)此方法篩選，初篩得到36株中性蛋白酶菌株，復(fù)篩得到的低溫中性蛋白酶菌株粗酶液酶活最高達到35.5U/ml ο
[0015]上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備上清液:將深海淤泥加到質(zhì)量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:10~20，得到第一懸浮液；漏斗過濾后再使用真空抽濾器過濾，得到的上清液經(jīng)121 °C高溫蒸汽滅菌15min ； (2)制備初篩培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；以質(zhì)量比計，初篩培養(yǎng)基中包括2.0%的干酪素和1.5%的瓊脂，余量為步驟I制備的上清液，pH為7.0 ;斜面培養(yǎng)基中包括1.0%的胰蛋白胨、0.5%的酵母膏、1.0%的NaCl和1.5%的瓊脂，余量為步驟I制備的上清液，pH為7.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基中包括4.0%的麩皮、0.1%的蛋白胨、0.4%的Na2HPO4.12H20和0.03%的KH2PO4，余量為步驟I制備的上清液，pH為7.0 ; (3)菌液濃縮:將深海淤泥加到質(zhì)量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:5~10，得到第二懸浮液，使用漏斗過濾，得到的上清液置于18~22°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6小時，得到濃縮后的菌液； (4)菌株初篩:將步驟3濃縮后的菌液加到質(zhì)量百分比為0.85%的無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋法稀釋6次，分別取各稀釋梯度的菌液置于步驟2制備的初篩培養(yǎng)基中，20~25°C下培養(yǎng)24~72小時；挑取透明圈大的菌株，在步驟2中制備的斜面培養(yǎng)基中保存； (5)菌種復(fù)篩:將初篩得到的菌種按體積比1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°C，200rpm培養(yǎng)48h ;得到的發(fā)酵液在8000r/min冷凍離心機中4°C離心15min,得到上清液即為粗酶液；以干酪素為底物，用福林酚法測定粗酶液酶活，進一步挑選出產(chǎn)酶能力強的菌株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法，本發(fā)明的方法通過對培養(yǎng)基改良，在培養(yǎng)基中添加海洋天然物質(zhì)，對樣品濃縮以增加單位體積微生物含量以及控制篩選條件等途徑，從我國東海海域約600m水深獲得的海洋淤泥中篩選得到產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株，最高粗酶酶活達35.5U/ml。
【IPC分類】C12Q1-37, C12Q1-04
【公開號】CN104561238
【申請?zhí)枴緾N201410845331
【發(fā)明人】錢利純, 閆豐英, 張曉旭
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月31日