CAGCGGGCTTCCTC
[0115] 反向引物序列 4D1-A-I :GCTGCGGAATTTTGGGATGG。
[0116] 二、配置PCR反應(yīng)液，
[0117] 每份用量如下：
[0118] 市售的 2 X PCR 反應(yīng)液（包括 taq 酶，UNG 酶，dNTP, dUTP) 10 μ L
[0119] 引物和探針混合物IyL
[0120] 內(nèi)參探針混合物1 μ L
[0121] RNase-free 水 7 μ L
[0122]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測探針，其特征在于，所示檢測探針的核苷酸序列選 自序列1和序列2,并且5'和3'端分別具有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，并且熒光基團(tuán)所發(fā)熒光 的波長峰值在不同的位置； 序列 1CYP2C9*2 突變型探針 5' -aacacAgtcctcaAtgctcc-3' 序列 2CYP2C9*2 野生型探針 5' -ttgaacacGgtcctcaatgctc-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測探針，其特征在于，所述的淬滅基團(tuán) 選自 MGB、BHQ2。 所述突變型探針和野生型探針上的熒光基團(tuán)選自不同的組； 第1組：FAM， 第 2 組：VIC, JOE, HEX 第 3 組：CY3, NED, TAMRA 第 4 組：ROX, TEXAS RED 第5組：CY5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測探針，其特征在于，所述突變型探針 和野生型探針上的熒光基團(tuán)分別選自FAM、HEX。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2的CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測探針，其特征在于，所述的淬滅基團(tuán) 選自 MGB、BHQ2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 一 3中任一項(xiàng)的CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測探針，其特征在于，所 述的探針選自如下群組： *2 突變型探針 FAM_aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2 *2 野生型探針 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2 *2 突變型探針 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc_BHQ2 *2 野生型探針 FAM_ttgaacacGgtcctcaatgctc_BHQ2 *2 突變型探針 FAM-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB *2 野生型探針 HEX-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB *2 突變型探針 HEX-aacacAgtcctcaAtgctcc-MGB *2 野生型探針 FAM-ttgaacacGgtcctcaatgctc-MGB *2 突變型探針 BHQ2_aacacAgtcctcaAtgctcc_FAM *2 野生型探針 BHQ2-ttgaacacGgtcctcaatgctc_HEX *2 突變型探針 BHQ2-aacacAgtcctcaAtgctcc_HEX *2 野生型探針 BHQ2_ttgaacacGgtcctcaatgctc_FAM *2 突變型探針 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-FAM *2 野生型探針 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-HEX *2 突變型探針 MGB-aacacAgtcctcaAtgctcc-HEX *2 野生型探針 MGB-ttgaacacGgtcctcaatgctc-FAM。
6. -種檢測CYP2C9*2基因多態(tài)性的試劑，其特征在于，所述的試劑包含權(quán)利要求1 一 5中任一項(xiàng)的檢測探針。
7. -種檢測CYP2C9*2基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含權(quán)利要求 1一 5中任一項(xiàng)的檢測探針。
8. -種基因擴(kuò)增用引物對，所述的引物對包括正向引物和反向引物；正向引物是由序 列3的堿基序列組成的寡核苷酸； 反向向引物由序列4的堿基序列組成的寡核苷酸。 序列 3D1-S-1 :AAGGCAGCGGGCTTCCTC 序列 4D1-A-1 :GCTGCGGAAITTTGGGATGG。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的基因擴(kuò)增用引物對，其特征在于，所述的基因擴(kuò)增用引物對是擴(kuò) 增生物樣品中CYP2C9*2基因的引物對。
10. -種基因擴(kuò)增用試劑，其特征在于，所述的基因擴(kuò)增用試劑含有權(quán)利要求8 - 9中 任一項(xiàng)所述的基因擴(kuò)增用引物對。
11. 一種基因擴(kuò)增用試劑盒，其特征在于，包含能使模板進(jìn)行擴(kuò)增的引物，所述的引物 對選自權(quán)利要求8 - 9中任一項(xiàng)所述的基因擴(kuò)增用引物對。
12. -種制備擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟： (I) 以樣品中的核酸為模板，使用權(quán)利要求8 - 9中任一項(xiàng)所述的基因擴(kuò)增用引物對， 在反應(yīng)液中進(jìn)行CYP2C9*2基因的擴(kuò)增步驟。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其特征在于，在所述的步驟（I)中，向 所述反應(yīng)液中進(jìn)一步添加與CYP2C9*2基因的檢測對象位點(diǎn)雜交的探針。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述的探針是選自權(quán)利 要求1 一 5中任一項(xiàng)的探針。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包含下 述步驟（II) (II) 測定所述反應(yīng)液的所述熒光標(biāo)記探針中的熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度的步驟。
16. -種試劑，其特征在于，所述的試劑含有選自權(quán)利要求1 一 5中任一項(xiàng)的探針以及 權(quán)利要求8 - 9中任一項(xiàng)所述的基因擴(kuò)增用引物對。
17. -種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有選自權(quán)利要求1 一 5中任一項(xiàng)的探針 以及權(quán)利要求8 - 9中任一項(xiàng)所述的基因擴(kuò)增用引物對。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有 Tris-HCl(pH 7. 5-9. 0)10-100mmol/L KCL 6-500mmol/L MgCl2L 5-5. Ommol/L dNTP 0. 2mmol/L 選自權(quán)利要求8 - 9中任一項(xiàng)的引物200-900nmol/L 選自權(quán)利要求1 一 5中任一項(xiàng)的探針100-900nmol/L 耐熱DNA聚合酶（Taq酶）2. 0-2. 5U。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有 Tris-HCl(pH 7. 5-9. 0)10-100mmol/L KCL 6-500mmol/L MgCl2L 5-5. Ommol/L dNTP 0. 2mmol/L 選自權(quán)利要求8 - 9中任一項(xiàng)的引物200-900nmol/L 選自權(quán)利要求1 一 5中任一項(xiàng)的探針100-900nmol/L 耐熱DNA聚合酶（Taq酶）2. 0-2. 5U 基因型外對照 內(nèi)對照。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其特征在于，所述的基因型外對照選自突變型基因型 對照、野生型基因型對照和雜合型基因型對照。
21. -種檢測CYP2C9*2基因多態(tài)性的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng) 的試劑盒來檢測CYP2C9*2基因多態(tài)性。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，該方法包 括如下步驟： (1) 將生物樣品進(jìn)行DNA提取； (2) 將提取的DNA加入權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的試劑盒中的試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 通過熒光信號的強(qiáng)度來確定CYP2C9*2基因多態(tài)性。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的生 物樣品是全血。
24. -種判斷華法林的使用量的方法，其特征在于，該方法包括： (1) 通過權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測方法來檢測CYP2C9*2基因多態(tài)性 的步驟； (2) 通過所檢測出的基因多態(tài)性來判斷華法林的適用量的步驟。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測探針，所述檢測探針的核苷酸序列選自序列1和序列2，5’和3’端分別具有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，并且熒光基團(tuán)所發(fā)熒光的波長峰值在不同的位置。優(yōu)選的淬滅基團(tuán)選自MGB、BHQ2；優(yōu)選的熒光基團(tuán)選自FAM，VIC,JOE,HEX、CY3,NED,TAMRA、ROX,TEXAS？RED、CY5等等。本發(fā)明還公開了一種基因擴(kuò)增用引物對，所述的引物對包括正向引物和反向引物；正向引物是由序列3的堿基序列組成的寡核苷酸；反向引物由序列4的堿基序列組成的寡核苷酸。本發(fā)明還公開了含有上述引物和探針的試劑盒以及CYP2C9*2基因多態(tài)性的檢測方法。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104561300
【申請?zhí)枴緾N201410851861
【發(fā)明人】李一石, 劉紅, 韓璐璐, 田蕾, 婁瑩, 王巍, 許建屏
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月31日