參與精子轉染外源dna的基因篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種參與精子轉染外源DNA的基因篩選方法。
【背景技術】
[0002] CD4分子是一類相對分子質量約為55 000 (單位）的單鏈跨膜糖蛋白，屬于免疫 球蛋白超家族，主要表達于部分T細胞、胸腺細胞、某些B細胞和EB病毒轉化的B細胞、單 核-巨噬細胞以及特定區(qū)域的腦細胞表面。其在T細胞發(fā)育、信號轉導、細胞間通訊、細胞 免疫應答和體液免疫應答的過程中發(fā)揮重要作用。然而，當CD4分子的正常免疫學功能失 調或遭到破壞時，即可能導致疾病的發(fā)生。近幾年的研宄表明，HIV-I的包膜糖蛋白gpl20 與T細胞表面的CD4受體結合，介導病毒進人細胞而造成細胞病變。同時，CD4分子作為精 子膜蛋白受體，有很多學者都進行了相關研宄，發(fā)現(xiàn)CD4在精子內化外源DNA上發(fā)揮著重要 作用。Lavitrano發(fā)現(xiàn)敲除⑶4基因的小鼠的精子具有與野生型小鼠相同的結合外源DNA 能力，不同的是CD4基因敲除小鼠精子內化外源DNA的能力也隨之消失，而野生型CD4小鼠 仍然有30%?54%的陽性率；野生型CD4小鼠的成熟精子與CD4抗體孵育后，其結合性能 與⑶4敲除小鼠完全一致，研宄表明⑶4可能參與了外源DNA的內化轉運機制。其他人的 研宄也顯示精子膜上⑶4參與外源DNA轉運；而且還發(fā)現(xiàn)封閉⑶4分子的精子仍部分具有 轉運外源DNA的能力。這說明精子結合轉運外源DNA不僅有⑶4發(fā)揮作用，而是多個分子 共同作用的結果。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種篩選參與精子轉染外源DNA基因的方法。按以下步驟進 行：
[0004] 一、構建重組質粒pGB-mCD4 ;
[0005] 二、cDNA文庫篩選獲得待測基因；
[0006] 三、待測基因陽性克隆抽提酵母質粒并擴增；
[0007] 四、質粒pGB-mCD4與待測基因陽性克隆酵母質粒共轉入酵母雙雜交菌株Y190 ;
[0008] 五、進行β -galactosidase顯色反應，顯色結果變藍的為陽性，分析，獲得參與精 子轉染外源DNA的基因。
[0009] 酵母雙雜交菌株Y190的報告基因為雙基因 HIS3和lacZ，可以減少雙雜交的結果 假陽性。本發(fā)明將誘餌載體pGB-mCD4轉入酵母雙雜交菌株Y190中，由于在酵母雙雜交菌 株Y190中CD4沒有與相互作用蛋白作用，誘餌載體的BD端不能和相互作用蛋白的AD相互 靠近進行作用，因此不能啟動下游報告基因 HIS3和IacZ的表達，表現(xiàn)為β -galactosidase 顯色不變藍。因此，本發(fā)明構建的誘餌載體pGB-mCD4在酵母雙雜交菌株Y190中不能自激 活（β -galactosidase顯色實驗結果為不變藍，如圖2所示）。
[0010] 利用誘館載體pGB-mCD4和待測基因質粒共轉酵母雙雜交菌株Y190,即進行酵母 雙雜交，之后再進行β-galactosidase顯色反應、分析，獲得可與⑶4相互作用的基因，得 到與⑶4共同作用轉運外源DNA的基因。
[0011] 通過本發(fā)明的方法能夠大量、快速的獲得與CD4共同作用轉運外源DNA的基因，為 精子介導基因轉移機理的研宄開辟新的思路，最終為建立簡單、穩(wěn)定、高效的精子介導轉基 因方法學奠定基礎。
【附圖說明】
[0012] 圖1是重組質粒pGB-mCD4的凝膠電泳圖。
[0013] 圖2是重組質粒pGB_mCD4的β -galactosidase顯色實驗結果圖。
[0014] 圖3是質粒pGB-mCD4與待測基因陽性克隆酵母質粒共轉入酵母雙雜交菌株Y190 后β-galactosidase顯色實驗陽性結果圖。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0015] 一：本實施方式參與精子轉染外源DNA的基因篩選方法，按以下步 驟進行基因篩選：
[0016] -、構建重組質粒pGB-mCD4 ;
[0017] 二、cDNA文庫篩選獲得待測基因；
[0018] 三、待測基因陽性克隆抽提酵母質粒并擴增；
[0019] 四、質粒pGB-mCD4與待測基因陽性克隆酵母質粒共轉入酵母雙雜交菌株Y190 ;
[0020] 五、進行β -galactosidase顯色反應，顯色結果變藍的為陽性，分析，獲得參與精 子轉染外源DNA的基因。
[0021] 重組質粒pGB_mCD4的β -galactosidase顯色實驗結果未變藍，為陰性，如 圖2所示。利用誘館載體pGB-mCD4和待測基因質粒共轉酵母雙雜交菌株Y190再進行 β -galactosidase顯色反應，β -galactosidase顯色結果變藍的為陽性（如圖3所示）， 說明BD與AD接近激活下游啟動子的報告基因表達，證明該基因與CD4共同作用轉運外源 DNA，參與了精子轉染外源DNA。
[0022] 重組質粒pGB_mCD4的β-galactosidase顯色實驗結果未變藍，為陰性，如圖2所 不O
【具體實施方式】 [0023] 二：本實施方式與一的不同點是：步驟一中的重組質 粒pGB_mCD4可按以下步驟構建：
[0024] ①目的片段的獲得：
[0025] SPF級昆明小鼠睪丸組織提取總RNA，逆轉錄cDNA第一鏈，進行PCR反應，PCR反應 體系如表1所示，PCR反應條件如表2所示；PCR引物為forward primer和reverse primer，
[0026] forward primer 序列為 5' -GGCCAATCCGGCC-3'，
[0027] reverse primer 序列為 5' -GGCCTCTAAGGCC-3' ；
[0028] 表 I
[0029]
【主權項】
1. 參與精子轉染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于按以下步驟進行基因篩選： 一、 構建重組質粒pGB_mCD4 ; 二、cDNA文庫篩選獲得待測基因； 三、 待測基因陽性克隆抽提酵母質粒并擴增； 四、 質粒pGB-mCD4與待測基因陽性克隆酵母質粒共轉入酵母雙雜交菌株Y190 ; 五、 進行0-galactosidase顯色反應，顯色結果變藍的為陽性，分析，獲得參與精子轉 染外源DNA的基因。
2. 權利要求1所述的參與精子轉染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于步驟一中的 重組質粒pGB-mCD4按以下步驟構建： ①目的片段的獲得： SPF級昆明小鼠睪丸組織提取總RNA，逆轉錄cDNA第一鏈，進行PCR反應，PCR反應體 系如下所示：
PCR反應條件如下所示：
PCR弓丨物為forwardprimer和reverseprimer,forwardprimer序列為 5' -GGCCAATCCGGCC-3'，reverseprimer序列為 5' -GGCCTCTAAGGCC-3' ； ② 回收目的片段mCD4; ③mCD4與pGB質粒載體連接 連接體系：連接1UL10XT4buffer、lyL濃度為50ng/yL的PGEM-T、1yL濃度為 150ng/yL的mCD4、0. 5yLT4連接酶和6. 5yL蒸餾水組成；16°C連接過夜或室溫lh以上； 即得到重組質粒pGB-mCD4。
3. 權利要求1所述的參與精子轉染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于步驟二中利 用MouseTestisMATCHMAKERcDNA文庫進行篩選。
4. 權利要求3所述的參與精子轉染外源DNA的基因篩選方法，其特征在于步驟二中按 以下步驟進行篩選： (1) 挑10個2mm克隆接種于lmLSD/-Trp液體培養(yǎng)基中，混勻后轉入150mLSD/-Trp振蕩培養(yǎng)20h(過夜），至0D6QQ= 1. 2 ; (2) 150mL培養(yǎng)液轉入 2000mLYPDA(YPD+Adenine)中混勻，此時 0D_