利用誘導(dǎo)損傷結(jié)合全基因組深度測(cè)序預(yù)測(cè)細(xì)胞成瘤性新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用誘導(dǎo)損傷結(jié)合全基因組深度測(cè)序預(yù)測(cè)細(xì)胞成瘤性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]因機(jī)體外部或內(nèi)部環(huán)境的影響，體細(xì)胞內(nèi)基因組時(shí)刻遭受著多種損傷。基因組DNA受損傷后，機(jī)體有一套完整的損傷修復(fù)方式來(lái)修復(fù)這些損傷，比如:光復(fù)活、切除修復(fù)、重組修復(fù)等。如果DNA損傷修復(fù)功能有缺陷，會(huì)導(dǎo)致兩種結(jié)果:一是細(xì)胞會(huì)通過(guò)凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)受損傷細(xì)胞死亡；二是受損傷的細(xì)胞發(fā)生基因突變而繼續(xù)存活。在第二種情況下，隨著細(xì)胞內(nèi)基因突變數(shù)的積累，正常的體細(xì)胞逐漸惡化為腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)癌癥。
[0003]癌癥的早期診斷對(duì)其成功治愈具有重要作用，然而長(zhǎng)期以來(lái)腫瘤的早期診斷標(biāo)記較少。為了尋找一種更全面且可應(yīng)用于多種癌癥的診斷方法，且基于基因突變積累是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，發(fā)明人提出了一種利用誘導(dǎo)損傷結(jié)合全基因組深度測(cè)序來(lái)預(yù)測(cè)靶細(xì)胞或組織成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)成瘤性的方法。
[0005]為了達(dá)到上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)細(xì)胞成瘤性的方法，其特征在于:
[0006]檢測(cè)靶細(xì)胞損傷修復(fù)后基因組的穩(wěn)定性和突變情況；
[0007]通過(guò)鑒定損傷修復(fù)后有無(wú)較多新增點(diǎn)突變，進(jìn)而預(yù)測(cè)靶細(xì)胞的成瘤性，評(píng)估靶細(xì)胞發(fā)展成腫瘤的可能性。
[0008]其中，所述損傷為低劑量輻射處理，優(yōu)選采用6tlCo進(jìn)行低劑量輻射處理。
[0009]其中，所述低劑量為4Gy。
[0010]其中，所述修復(fù)的時(shí)間為4小時(shí)。
[0011]其中，所述檢測(cè)為全基因組深度測(cè)序。
[0012]其中，所述檢測(cè)為檢測(cè)靶細(xì)胞中基因組的變異。
[0013]其中，所述的變異包括點(diǎn)突變和小片段插入與缺失。
[0014]其中，所述評(píng)估是通過(guò)與相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞相比，檢測(cè)靶細(xì)胞中是否存在較多輻射所引起的點(diǎn)突變或小片段插入與缺失。
[0015]其中，若存在新增變異，且數(shù)量較多，說(shuō)明其基因組穩(wěn)定性較差，所述靶細(xì)胞存在潛在的成瘤性。
[0016]具體地，本發(fā)明提供一種利用誘導(dǎo)損傷結(jié)合全基因組深度測(cè)序的方法來(lái)預(yù)測(cè)細(xì)胞基因組穩(wěn)定性，進(jìn)而預(yù)測(cè)其成瘤性高低的方法。
[0017]本發(fā)明中所涉細(xì)胞系包括小鼠成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞及小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞。所使用的方法包括通過(guò)低劑量照射三種細(xì)胞系，檢測(cè)其照射前后DNA損傷修復(fù)能力及其基因組穩(wěn)定性。
[0018]優(yōu)選地，所述低劑量輻射處理為通過(guò)6tlCo進(jìn)行低劑量輻射處理。
[0019]優(yōu)選地，所述低劑量為4Gy。
[0020]優(yōu)選地，低劑量照射后，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為4小時(shí)。
[0021]通過(guò)以下分子生物學(xué)方法鑒定三種細(xì)胞系DNA損傷修復(fù)能力的高低:
[0022]分別檢測(cè)了三種細(xì)胞系照射前后其各自細(xì)胞核內(nèi)γΗ2ΑΧ的水平(在受同等損傷情況下，γ Η2ΑΧ的表達(dá)水平越高，其DNA損傷修復(fù)能力越高)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞在低劑量照射后，小鼠成纖維細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞中γΗ2ΑΧ水平較照射前有明顯的提升，且高于小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，說(shuō)明小鼠成纖維細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞具有較高的DNA損傷修復(fù)能力來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性，而小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞則具有較低損傷修復(fù)能力。
[0023]通過(guò)以下高通量測(cè)序方法鑒定三種細(xì)胞系基因組穩(wěn)定性的高低:
[0024]利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)照射前后的三種細(xì)胞系，共6個(gè)樣本進(jìn)行了全基因組深度測(cè)序。以每種細(xì)胞系照射前的測(cè)序結(jié)果作空白對(duì)照，尋找照射后新產(chǎn)生的基因組變異。若基因組變異越多，說(shuō)明其基因組穩(wěn)定性越差。反之，則基因組穩(wěn)定性越高。
[0025]細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)能力、基因組穩(wěn)定性及其成瘤性的關(guān)系:
[0026]所涉及的三種細(xì)胞系中，小鼠誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞較其他兩種細(xì)胞在體內(nèi)具有較高的成瘤性，而其較差的基因組穩(wěn)定性是其成瘤性高的一個(gè)重要原因。因此，通過(guò)全基因組深度測(cè)序來(lái)檢驗(yàn)細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性，進(jìn)而預(yù)測(cè)其致癌性是一種適用可行的方法。
[0027]該方法的檢測(cè)手段是直接通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞損傷修復(fù)后基因突變情況來(lái)預(yù)測(cè)其成瘤性的高低。因此，相對(duì)于其它檢測(cè)基因組穩(wěn)定性的方法，如免疫熒光等，該方法簡(jiǎn)便易行，適用于癌癥在發(fā)生前的檢測(cè)。且隨著高通量測(cè)序技術(shù)成本的降低，特別是成本更低的第三代測(cè)序技術(shù)的上市，能夠在一天內(nèi)完成全部基因組測(cè)序，而且所需花費(fèi)不到1000美元，該方法的可用性也隨之增加，同時(shí)也為未來(lái)的精準(zhǔn)化個(gè)體醫(yī)療提供了一定的理論基礎(chǔ)。此外，利用此方法，還可通過(guò)抽取機(jī)體中血液，通過(guò)檢測(cè)其在照射后新增突變數(shù)的多少來(lái)判斷其個(gè)體基因組穩(wěn)定性，進(jìn)而預(yù)測(cè)其患癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0028]有益效果:
[0029]本發(fā)明利用DNA損傷誘導(dǎo)結(jié)合高通量測(cè)序，提供了一種可廣泛用于提前預(yù)測(cè)多種癌癥的新方法。本方法可以取任何人體樣本預(yù)先處理評(píng)估正常人的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，較目前只能在已經(jīng)發(fā)生癌變階段進(jìn)行免疫和分子檢測(cè)，具有不可替代的優(yōu)越性。此外高通量測(cè)序成本的降低，尤其是最近低成本第三代高通量測(cè)序技術(shù)的上市，使該方法的實(shí)用性和領(lǐng)先性得到保障。本發(fā)明的方法可以有效用于癌癥的早期快速診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力低于胚胎干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
[0031]圖2顯示同等劑量輻射造成DNA損傷后，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞基因組穩(wěn)定性低于胚胎干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，其并不用于限制本發(fā)明。
[0033]實(shí)施例1三種細(xì)胞系DNA損傷修復(fù)能力高低的鑒定
[0034]1.低劑量照射三種細(xì)胞系
[0035]I)照射前兩天在六孔板中鋪蓋玻片，并將三種細(xì)胞系:小鼠成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞及小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞傳代于鋪好蓋玻片的六孔板中。
[0036]2)照射前一天更換新鮮培養(yǎng)基。
[0037]3)三種細(xì)胞系在同等條件下經(jīng)過(guò)同位素6tlCo放射源、4Gy照射處理。
[0038]2.免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞核中γΗ2ΑΧ水平
[0039]I)照射后，將三種細(xì)胞系放回二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
[0040]2) 4小時(shí)后，倒去培養(yǎng)基，并用PBS緩沖液清洗3次。
[0041]3) 4%甲醛室溫固定10分鐘，并用PBS緩沖液清洗I次。
[0042]4)冰上通透 10 分鐘(通透液:0.05% TritonX-100,0.5% ΝΡ-40)，并用 PBS 緩沖液清洗3次。
[0043]5)用2%胎牛血清室溫封閉I小時(shí)。
[0044]6) 一抗室溫孵育 I 小時(shí)(γ Η2ΑΧ 抗體:1:500 ；Millipore, CA, USA)，并用 PBST 緩沖液清洗3次。
[0045]7) 二抗室溫孵育 I 小時(shí)(抗鼠抗體:1:800，Abeam, Cambridge, MA, USA)，并用 PBST緩沖液清洗3次。
[0046]8)封片，使用共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5)觀測(cè)。
[0047]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0048]在低劑量照射后，與小鼠成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞相比，小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞中YH2AX水平上升不明顯，說(shuō)明其較低的DNA損傷修復(fù)能力可能導(dǎo)致其基因組的不穩(wěn)定性(見(jiàn)圖1)。
[0049]實(shí)施例2全基因組深度測(cè)序檢測(cè)基因組穩(wěn)定性
[0050]1.細(xì)胞DNA的提取
[0051]I)照射4小時(shí)后(同上實(shí)驗(yàn)例步驟I)，用PBS緩沖液清洗I次，用細(xì)胞刮直接收取小鼠成纖維細(xì)胞；使用明膠重懸法收取小鼠胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。
[0052]2)使用 DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Germany)提取各細(xì)胞系DNA0
[0053]2.文庫(kù)構(gòu)建
[0054]I)用 DNA 片段化儀器(Covaris S220，Life Technologies)將 5 微克 DNA 隨機(jī)打斷成300 - 500bp的片段。
[0055]2)末端補(bǔ)平。
[0056]3)片段兩端加接頭。
[0057]4) PCR 擴(kuò)增。
[0058]3.上機(jī)測(cè)序
[0059]構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)質(zhì)檢后，使用HiSeq2000 (Illumina)進(jìn)行檢測(cè)。
[0060]4.測(cè)序數(shù)據(jù)分析
[0061]I)將原始fastq數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量處理。
[0062]2)使用bwa軟件將處理過(guò)的數(shù)據(jù)與小鼠參考基因組進(jìn)行比對(duì)。
[0063]3)使用samtools軟件篩選各細(xì)胞系的變異。
[0064]4)使用VarScan軟件對(duì)比各細(xì)胞系照射前后的差異，找出由照射所引起的基因組變異。
[0065]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0066]在低劑量照射后，小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞中照射所引起的點(diǎn)突變和小片段插入數(shù)量遠(yuǎn)大于其他兩種細(xì)胞系(見(jiàn)圖2)。說(shuō)明小鼠誘導(dǎo)功能干細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于小鼠成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，揭示了其在體內(nèi)較高致癌性的重要原因。
[0067]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種預(yù)測(cè)細(xì)胞成瘤性的方法，其特征在于: 檢測(cè)靶細(xì)胞損傷修復(fù)后基因組的穩(wěn)定性和突變情況； 通過(guò)鑒定損傷修復(fù)后有無(wú)較多新增點(diǎn)突變，進(jìn)而預(yù)測(cè)靶細(xì)胞的成瘤性，評(píng)估靶細(xì)胞發(fā)展成腫瘤的可能性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述損傷為低劑量輻射處理，優(yōu)選采用6tlCo進(jìn)行低劑量福射處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述低劑量為4Gy。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述修復(fù)的時(shí)間為4小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述檢測(cè)為全基因組深度測(cè)序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，所述檢測(cè)為檢測(cè)靶細(xì)胞中基因組的變異。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述的變異包括點(diǎn)突變和小片段插入與缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述評(píng)估是通過(guò)與相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞相比，檢測(cè)靶細(xì)胞中是否存在較多輻射所引起的點(diǎn)突變或小片段插入與缺失。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中若存在新增變異，且數(shù)量較多，說(shuō)明其基因組穩(wěn)定性較差，所述靶細(xì)胞存在潛在的成瘤性。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)細(xì)胞成瘤性的方法，所述方法通過(guò)誘導(dǎo)靶細(xì)胞DNA損傷，經(jīng)一定時(shí)間修復(fù)后，檢測(cè)靶細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性和突變情況，進(jìn)而預(yù)測(cè)其成瘤性的高低。所述檢測(cè)是通過(guò)高通量全基因組深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行判斷。所述判斷的標(biāo)準(zhǔn)是檢測(cè)DNA損傷修復(fù)后新增突變數(shù)量的多少，如果與正常細(xì)胞相比突變數(shù)量明顯增多，則說(shuō)明靶細(xì)胞具有潛在成瘤性。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104561347
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510037304
【發(fā)明人】孫英麗, 張敏杰
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月23日