Her2基因擴(kuò)增檢測(cè)探針、試劑盒以及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及HER2基因擴(kuò)增 檢測(cè)探針、試劑盒以及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類(lèi)HER-2/neu基因（Her-2基因）基因定位于染色體17q21，其編碼產(chǎn)物為185kD 的跨膜精蛋白P185,由1255個(gè)氨基酸組成，720- 987位屬于酪氨酸激酶區(qū)，其結(jié)構(gòu)示意圖 如圖1所示。Her-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜慵蛋白，是EGFR家族成員之 一。Her-2/neu蛋白由胞外的配體結(jié)合區(qū)、單鏈跨膜區(qū)及胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶區(qū)三部分 組成，由于目前尚未發(fā)現(xiàn)能與Her-2/neu蛋白直接結(jié)合的配體.其主要通過(guò)與家族中其他 成員包括EGFR(HERVerbBI)，HER3/erbB3。HER4/erbB4形成異二聚體而與各自的配體結(jié) 合。Her-2/neu蛋白常為異二聚體首選伴侶，且活性常強(qiáng)于其它異二聚體。當(dāng)與配體結(jié)合 后，主要通過(guò)引起受體二聚化及胞漿內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)的自身磷酸化.激活酪氨酸激酶的活 性。Her-2/neu蛋白在胃癌中的表達(dá)情況及影響因素 Her-2/neu蛋白通常只在胎兒時(shí)期表 達(dá)，成年以后只在極少數(shù)組織內(nèi)低水平表達(dá)。然而在多種人類(lèi)腫瘤中卻過(guò)度表達(dá)，如乳腺 癌、卵巢癌、肺腺癌、原發(fā)性。腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等，并提示預(yù)后不良。熒光原位雜交的 方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中Her-2/neu基因（17ql2)的擴(kuò)增，作為判斷預(yù)后以及乳腺癌藥物治 療，尤其是抗HER-2單克隆抗體（赫賽?。┌邢蛑委煹囊豁?xiàng)輔助檢測(cè)手段。
[0003] 目前檢測(cè)HER2基因的方法包括：免疫組織化學(xué)（IHC)法檢測(cè)HER2蛋白過(guò)表達(dá)、熒 光原位雜交（FISH)法檢測(cè)HER2基因拷貝數(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)檢測(cè)血清HER2E⑶ 或腫瘤組織P185。但病理常規(guī)工作中最實(shí)用的方法是IHC和FISH。IHC較FISH節(jié)約成本、 簡(jiǎn)單易行，但容易受到組織處理方法、固定時(shí)間等影響，其結(jié)果判斷和解釋存在較大的變 異，而FISH具有高度的重復(fù)性和可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒可用于高特異性 和高準(zhǔn)確性檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增的情況。
[0005] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0006] HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括有標(biāo)記熒光染料的、針對(duì)HER2基因的第一組探針 和針對(duì)人類(lèi)17號(hào)染色體著絲粒區(qū)域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41- SEQ ID NO. 50中的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中 的至少一條探針；上述兩組探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光染料顏色不一樣。
[0007] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
[0008] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少八條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少八條探針。
[0009] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一組探針為SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50,所述第 二組探針為 SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60。
[0010] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分別由以下引物擴(kuò) 增制備得到：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分別由以下引物擴(kuò) 增制備得到：SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、 SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)探針。
[0013] 實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下：
[0014] HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)探針，針對(duì)HER2基因的第一組探針和針對(duì)人類(lèi)17號(hào)染色體著 絲粒區(qū)域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一 條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一條探針。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
[0016] 本發(fā)明的另一目的是提供一種HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)方法。
[0017] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0018] -種HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)方法，包括
[0019] 待檢測(cè)樣品切片預(yù)處理；
[0020] 利用上述HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒進(jìn)行雜交檢測(cè)；
[0021] 復(fù)染后在顯微鏡下觀察焚光信號(hào)。
[0022] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0023] 1.本發(fā)明所提供的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與Cytocell公司產(chǎn)品 HER2檢測(cè)產(chǎn)品的吻合率高達(dá)100%。
[0024] 2.本發(fā)明制備的檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增的FISH探針，不含有重復(fù)序列，能夠避免交叉 反應(yīng)，與染色體中HER2目標(biāo)檢測(cè)片段進(jìn)行識(shí)別雜交，具有準(zhǔn)確性高，特異性好、及假陽(yáng)性低 的優(yōu)點(diǎn)。
[0025] 3.本發(fā)明所述試劑盒的操作簡(jiǎn)單、安全，同時(shí)減少了 Cot-IDNA試劑、羅丹明抗-地 高辛抗體等昂貴試劑的使用，經(jīng)濟(jì)高效；
[0026] 4.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述試劑盒的檢測(cè)方法，無(wú)需使用Cot-IDNA對(duì)樣本基 因進(jìn)行封閉，操作方便，檢測(cè)速度快，可在12-24小試內(nèi)完成雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為信號(hào)選擇與計(jì)數(shù)指南示意圖，其中，黑色點(diǎn)表示紅色信號(hào)點(diǎn)；白色點(diǎn)表示綠 色信號(hào)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā) 明的保護(hù)范圍不局限于下面的實(shí)施例。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 本實(shí)施例所述的檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)探針和試劑盒，其設(shè)計(jì)如下：
[0031] 一、設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物
[0032] 分別針對(duì)HER2基因和人類(lèi)17號(hào)染色體著絲粒區(qū)域設(shè)計(jì)兩組擴(kuò)增引物，其中第一 組為針對(duì)HER2的擴(kuò)增引物，第二組為針對(duì)人類(lèi)17號(hào)染色體著絲粒區(qū)域的擴(kuò)增引物，相應(yīng)的 擴(kuò)增產(chǎn)物分別組成了第一組探針庫(kù)和第二組探針庫(kù)。每組擴(kuò)增引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物能作為 重排的FISH探針，不含有重復(fù)序列，能夠避免交叉反應(yīng)，與染色體中HER2目標(biāo)檢測(cè)片段進(jìn) 行特異性識(shí)別雜交。
[0033] 人工合成如下引物，擴(kuò)增引物及其相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物具體見(jiàn)表1(注：1F/1R為一 對(duì)引物，分別表示正向引物和反向引物；其他以此類(lèi)推）。合成后的每條擴(kuò)增引物分別用 10mmol/L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的存液。
[0034] 表1擴(kuò)增引物及擴(kuò)增產(chǎn)物
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括有標(biāo)記熒光染料的、針對(duì)HER2基因的 第一組探針和針對(duì)人類(lèi)17號(hào)染色體著絲粒區(qū)域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少一條探針；所述第一組探針與第二組探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光染料顏色不一 樣。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一組探針 為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一組探針 為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少八條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少八條探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一組探針為 SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50,所述第二組探針為 SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分別由以下引物擴(kuò)增制備得到：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分別由以下引物擴(kuò)增制備得到：SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、 SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。 7. HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)探針，其特征在于，針對(duì)HER2基因的第一組探針和針對(duì)人類(lèi)17號(hào) 染色體著絲粒區(qū)域，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一條探 針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一條探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)探針，其特征在于，所述第一組探針為 選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
9. 一種HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： 待檢測(cè)樣品切片預(yù)處理； 利用權(quán)利要求1一6任一項(xiàng)所述HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒進(jìn)行雜交檢測(cè)； 復(fù)染后在顯微鏡下觀察焚光信號(hào)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)探針、試劑盒以及方法，包括有標(biāo)記熒光染料的、針對(duì)HER2基因的第一組探針和針對(duì)人類(lèi)17號(hào)染色體著絲粒區(qū)域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一條探針；上述兩組探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光染料顏色不一樣。本發(fā)明所提供的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒中的FISH探針，不含有重復(fù)序列，能夠避免交叉反應(yīng)，與染色體中HER2目標(biāo)檢測(cè)片段進(jìn)行識(shí)別雜交，具有準(zhǔn)確性高，特異性好、及假陽(yáng)性低的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104561361
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510053892
【發(fā)明人】胡文暉, 吳詩(shī)揚(yáng), 廖傳榮, 黃萌
【申請(qǐng)人】益善生物技術(shù)股份有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月30日