段保守序列 (2307-2464),其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。設(shè)計引物與探針時,注意避開序列的突 變點(diǎn),經(jīng)反復(fù)篩選和驗(yàn)證,得到一對用于檢測金魚造血器官壞死病病毒的熒光定量PCR引 物和與引物配合使用的探針,
[0040] 上游引物:CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQ ID NO. 2)
[0041] 下游引物:ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO. 3)。
[0042] 突光探針序列為:
[0043] 5'-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQ ID NO. 4)。
[0044] 實(shí)施例2檢測金魚造血器官壞死病病毒的熒光定量PCR檢測方法的建立
[0045] 1、作為陽性對照的重組質(zhì)粒構(gòu)建。
[0046] 將目的基因連接入T載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,通過藍(lán)白 斑技術(shù)篩選重組質(zhì)粒。使用商業(yè)化質(zhì)粒提純試劑盒提純重組質(zhì)粒。
[0047] 每組樣品都設(shè)立1個陽性對照樣品和陰性對照樣品。陽性對照樣品為上述重組質(zhì) 粒;陰性對照樣品為去離子水。
[0048] 2、根據(jù)Ct值和熒光信號的強(qiáng)弱來判斷優(yōu)化條件,把最佳的條件組合起來作為最 終的優(yōu)化體系。
[0049] 退火溫度從55 °C?65 °C之間進(jìn)行優(yōu)化;mg2+濃度在1. 5?5mM之間進(jìn)行優(yōu)化; dNTPs濃度在2?5. 8mM之間進(jìn)行優(yōu)化。最終確定的金魚造血器官壞死病病毒熒光定量 25 μ L PCR反應(yīng)體系見表1 :
[0050] 表1金魚造血器官壞死病病毒突光定量PCR反應(yīng)體系
[0051] 試劑 體積(μ?^) IOxPCR Buffer ( 15mM MgCl2) 2.5 dNTP (2.5mM each) 2.0
[0052] Tag polymerase ( 5U ) 0.5 上游引物(lOpmol/ul) 1.5 下游引物(lOpmol/ul) 1.5 探針(lOpmol/ul) I DNA模版 I MgCl2 ( 25mM ) 2 CldH2O 13。
[0053] 3、實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件
[0054] 95 °C 3 min 95 C 30s 5930s I 40 個循環(huán)
[0055] 同時設(shè)立無模板對照和陽性對照,根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
[0056] 4、反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)熒光定量PCR儀顯示圖片判斷檢測結(jié)果:
[0057] 陰性樣品沒有擴(kuò)增曲線出現(xiàn),陽性樣品有明顯擴(kuò)增曲線,且Ct值小于25。此時陰 性對照和陽性對照都成立,可以對待測樣品起對照作用;若待測樣品擴(kuò)增曲線Ct值小于或 等于38,則說明樣品為GFHNV核酸陽性;若待測樣品無擴(kuò)增曲線,或擴(kuò)增曲線Ct值大于38, 則樣品為GFHNV核酸陰性。
[0058] 實(shí)施例3金魚造血器官壞死病病毒熒光定量PCR檢測方法的特性評價
[0059] 1、靈敏度評價,靈敏度即real-time PCR的最低檢測限。
[0060] 陽性參考DNA原液濃度為IOiciCopies/μ L。先將其10倍梯度稀釋至IOcopies/ μ L,再分別以每個稀釋度的溶液為模板,采用本發(fā)明實(shí)施例2建立的熒光定量PCR方法進(jìn) 行擴(kuò)增,確定該方法最低可以檢測到的模板量。根據(jù)檢測結(jié)果,該熒光定量PCR方法最低可 檢測到100個拷貝的DNA模板。
[0061] 2、特異度評價。
[0062] 采用本發(fā)明實(shí)施例2建立的熒光定量PCR方法,對金魚造血器官壞死病毒、錦鯉皰 疹病毒(KHV)、傳染性造血器官壞死病毒(EHNV)、中華鱉虹彩病毒(STIV)、斑點(diǎn)叉尾鮰病毒 (CCV)和對蝦白斑病病毒(WSSV)等水產(chǎn)病毒進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖1。圖1顯示只有GFHNV 樣品(箭頭所指)有曲線,其他病毒DNA無曲線,說明本發(fā)明方法對KHV、EHNV、STIV、CO^P WSSV無交叉反應(yīng),對金魚造血器官壞死病病毒檢測結(jié)果呈現(xiàn)陽性。說明本發(fā)明方法具有優(yōu) 異的特異性。
[0063] 實(shí)施例4檢測金魚造血器官壞死病病毒的臨床應(yīng)用
[0064] 1、待撿樣品DNA的提取
[0065] 待檢的病金魚,取肝、脾、腎、腦和鰓。
[0066] 將魚組織混合,研磨成糊狀后,使用酚氯仿或商業(yè)化組織DNA提取試劑盒,提取樣 品總DNA。
[0067] 將提取的總DNA作為模板,使用本發(fā)明實(shí)施例2的GFHNV熒光定量PCR檢測方法 檢測是否感染GFHNV。
[0068] 2、采用傳統(tǒng)的PCR方法檢測GFHNV對上述待檢樣品進(jìn)行驗(yàn)證。引物序列:上游引 物:CCCAGCAACATGTGCGACGG ;下游引物:CCGTARTGAGAGTTGGCGCA ;目的基因長度 362bp。
[0069] 結(jié)果顯示該傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果與本發(fā)明實(shí)施例2建立的GFHNV熒光定量PCR檢 測方法檢測的陽性結(jié)果與陰性結(jié)果均相一致,說明本發(fā)明建立的GFHNV熒光定量PCR檢測 方法具有較高準(zhǔn)確率。
[0070] 雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對之作一些修改或改進(jìn),這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測金魚造血器官壞死病病毒的特異性引物,其擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如 SEQIDNO. 1 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的特異性引物,其核苷酸序列為: 上游引物:CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT, 下游引物:ATCCGGCACAGGTGGCGTGT。
3. 與權(quán)利要求1或2所述特異性引物配合使用的熒光探針。
4. 如權(quán)利要求3所述的熒光探針,其核苷酸序列為: 5 ' -FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN。
5. 權(quán)利要求1或2所述的引物和權(quán)利要求3或4所述的熒光探針在制備檢測金魚造血 器官壞死病病毒試劑盒中的應(yīng)用。
6. 含有權(quán)利要求1或2所述的引物和權(quán)利要求3或4所述的熒光探針的試劑盒。
7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于,以樣品總DNA為模板,利用權(quán)利要求1或 2所述的引物和權(quán)利要求3或4所述探針進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR,根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒,其特征在于,其25yL實(shí)時熒光定量PCR工作體系為:
9. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒,其特征在于,實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù) 變性3min,1個循環(huán);95°C變性30s,59°C退火30s,40個循環(huán)。
10. 權(quán)利要求6-9任一所述的試劑盒在檢測金魚造血器官壞死病病毒中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于檢測金魚造血器官壞死病病毒試劑盒。本發(fā)明首先提供了用于檢測金魚造血器官壞死病病毒的實(shí)時熒光定量PCR引物和探針,其序列分別如SEQ?ID?NO2,SEQ?ID?NO3和SEQID?NO4所示。本發(fā)明還提供了使用上述引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測金魚造血器官壞死病病毒的方法。本發(fā)明的檢測方法及其檢測試劑盒具有檢測準(zhǔn)確,靈敏度高、特異性強(qiáng),簡便快速的優(yōu)點(diǎn),具有良好的臨床標(biāo)本檢測能力。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104561373
【申請?zhí)枴緾N201410773825
【發(fā)明人】張旻, 景宏麗, 王娜, 吳紹強(qiáng)
【申請人】中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月12日