呼吸系統(tǒng)常見病原體的實時熒光多重pcr快速檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及呼吸系統(tǒng)常見病原體的實時熒光多重 PCR快速檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道感染是我國的常見病、多發(fā)病，感染的病原有細菌、病毒、支原體等，感染者 從感冒到肺炎，可呈現(xiàn)不同的癥狀，引發(fā)嚴重的合并癥甚至死亡。
[0003] 呼吸道感染分為上呼吸道感染和下呼吸道感染，前者表現(xiàn)為急性鼻炎、咽炎和喉 炎，后者表現(xiàn)為急性氣管炎、支氣管炎和肺炎。上呼吸道感染的感染原因可以是細菌或真 菌。90%左右由病毒引起，細菌感染常繼發(fā)于病毒感染之后。下呼吸感染的病因主要是細菌 和真菌。由于病毒的類型較多，人體對各種病毒感染后產(chǎn)生的免疫力較弱且短暫，并無交叉 免疫，同時在健康人群中有病毒攜帶者，故一個人一年內(nèi)可有多次發(fā)病。據(jù)某省中醫(yī)院急診 科統(tǒng)計，以發(fā)熱就診的病人占急診門診總數(shù)的40%左右，其中急性病毒性上呼吸道感染發(fā) 熱患者約就占其中的80%以上。因此，對呼吸道病原體的快速、準確的診斷十分必要。在成 年人和兒童中，急性呼吸道感染是最普遍的急性傳染病，并且病原體種類繁多，這就給診斷 帶來巨大挑戰(zhàn)。
[0004] 目前，臨床上最準確的呼吸道病原體檢測方法為病毒培養(yǎng)，具有特異性高的特點， 是臨床診斷的"金標準"。但培養(yǎng)法耗時、敏感性低、對實驗操作要求高。此外還有細菌培養(yǎng) 和藥敏法，可以監(jiān)測耐藥情況，但樣本易污染，對結(jié)果影響大；病毒抗原的測定可作為感染 證據(jù)，檢測快速，但敏感性低，且不能區(qū)分污染和定植菌；特異性抗體檢測，可作早期診斷， 特異性及敏感性高，但受到抗體動力學(xué)的影響。熒光核酸PCR技術(shù)具有敏感性高，檢測快速 等優(yōu)點，預(yù)期將會在臨床診斷中有廣泛的應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的熒光實時PCR每次只能擴增一 種病原體的核酸，要準確找出致病病原體需多次嘗試，耗費大量的時間和精力，并且對于多 種病原體導(dǎo)致的感染無法有效區(qū)分。新型的多重實時熒光PCR可以有效彌補單重PCR的這 些缺陷，是一種非常有應(yīng)用前景的診斷方法。
[0005] 要成功實施多重PCR，需要解決幾個技術(shù)問題：(|)由于每一種擴增子的最佳擴增 條件都不一樣，需要協(xié)調(diào)每個單獨反應(yīng)的條件以保證在單一擴增條件下各擴增子都能進行 成功擴增。（g由于需要使用多組引物/探針組合，不同引物/探針之間互相產(chǎn)生交聯(lián)的可 能性很大，因此在設(shè)計時需要考慮消除這一可能性。i:gl_組引物/探針不能對其他目標和 非目標核酸序列有交叉同源性，以防止產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，影響對疾病的診斷。Γ?)需要有 一定的方法來排除來自于核酸提取方面的問題，這就要求有內(nèi)對照作為參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是解決不同引物/探針之間互相產(chǎn)生交聯(lián)的問題，提供呼吸系統(tǒng)常 見病原體的實時熒光多重PCR快速檢測試劑盒，能夠快速、精確、有效的進行測定。
[0007] 本發(fā)明為解決上述問題所采取的技術(shù)方案是：呼吸系統(tǒng)常見病原體的實時熒光多 重PCR快速檢測試劑盒，試劑盒內(nèi)設(shè)有陽性對照、陰性對照和內(nèi)對照，該試劑盒內(nèi)還設(shè)有用 于檢測流感A病毒、HlNl亞型病毒、流感B病毒、鼻病毒、冠狀病毒229E、冠狀病毒HKU1、冠 狀病毒NL63、冠狀病毒0C43、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、人博卡病毒、人偏 肺病毒、副流感病毒1、肺炎支原體、腺病毒、腸病毒、雙?？刹《竞秃粑篮习《局幸环N 或多種病原體的多種引物及探針的混合物，其中，用于流感A病毒檢測的引物序列分別為 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :3,熒光標記為FAM ;用于 HlNl亞型病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，Taqman探針序列 為SEQ ID NO :6,熒光標記為Cy5;用于流感B病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :7 和SEQ ID NO :8，Taqman探針序列為SEQ ID NO :9,熒光標記為ROX ;用于鼻病毒檢測的引 物序列分別為SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :12,熒 光標記為VIC ;用于冠狀病毒229E檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :13和SEQ ID NO : 14 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO : 15,熒光標記為FAM ;用于冠狀病毒HKUl檢測的引物序 列分別為SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :18,熒光標 記為ROX ;用于冠狀病毒NL63檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20， Taqman探針序列為SEQ ID NO :21，熒光標記為VIC ;用于冠狀病毒0C43檢測的引物序列分 別為SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23，Taqman探針序列為SEQ ID NO :24,熒光標記為 Cy5;用于副流感病毒2檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26 ,Taqman 探針序列為SEQ ID NO :27,熒光標記為VIC ;用于副流感病毒3檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :28和SEQ ID NO :29，Taqman探針序列為SEQ ID NO :30,熒光標記為FAM;用于副 流感病毒4檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :31和SEQ ID NO :32，Taqman探針序列 為SEQ ID NO :33,熒光標記為ROX ;用于人博卡病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :34 和SEQ ID NO :35, Taqman探針序列為SEQ ID NO :36,熒光標記為ROX ;用于人偏肺病毒 檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :37和SEQ ID NO :38, Taqman探針序列為SEQ ID NO :39,熒光標記為VIC ;用于副流感病毒1檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :40和SEQ ID NO :41 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :42,熒光標記為FAM ;用于肺炎支原體檢測的引物 序列分別為SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :44 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :45,熒光標 記為Cy5;用于腺病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :46和SEQ ID NO :47 ,Taqman 探針序列為SEQ ID NO :48,熒光標記為Cy5;用于腸病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :49和SEQ ID NO :50, Taqman探針序列為SEQ ID NO :51，熒光標記為ROX ;用于雙埃 可病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :52和SEQ ID NO :53, Taqman探針序列為SEQ ID NO :54,熒光標記為VIC ;用于呼吸道合胞病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :55 和SEQ ID NO :56，Taqman探針序列為SEQ ID NO :57,熒光標記為FAM;所述的內(nèi)對照為馬 動脈炎病毒，用于馬動脈炎病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :58和SEQ ID NO :59 ，Taqman探針序列為SEQ ID NO :60,熒光標記為Cy5。
[0008] 有益效果 本發(fā)明所涉及的檢測試劑盒，避免了不同引物/探針之間互相產(chǎn)生交聯(lián)的問題，每組 引物/探針不會對其他目標和非目標核酸序列產(chǎn)生交叉同源性，可實現(xiàn)一次反應(yīng)同時檢測 多種引起呼吸系統(tǒng)感染的常見病原體，檢測所需時間短，準確性高，為臨床和檢測實驗室提 供了有力的檢測工具。
【具體實施方式】
[0009] 呼吸系統(tǒng)常見病原體的實時熒光多重PCR快速檢測試劑盒，試劑盒內(nèi)設(shè)有陽性對 照、陰性對照和內(nèi)對照，該試劑盒內(nèi)還設(shè)有用于檢測流感A病毒、HlNl亞型病毒、流感B病 毒、鼻病毒、冠狀病毒229E、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒NL63、冠狀病毒0C43、副流感病毒2、 副流感病毒3、副流感病毒4、人博卡病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1、肺炎支原體、腺病毒、 腸病毒、雙?？刹《竞秃粑篮习《局幸环N或多種病原體的多種引物及探針的混合物， 其中，用于流感A病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ,Taqman探 針序列為SEQ ID NO :3,熒光標記為FAM ;用于HlNl亞型病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :6,熒光標記為Cy5;用于流感 B病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，Taqman探針序列為SEQ ID NO :9,熒光標記為ROX ;用于鼻病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :12,熒光標記為VIC ;用于冠狀病毒229E檢測的引物 序列分別為SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :15,熒光 標記為FAM ;用于冠狀病毒HKUl檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :16和SEQ ID NO : 17 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :18,熒光標記為ROX ;用于冠狀病毒NL63檢測的引物序 列分別為SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :21，熒光標 記為VIC