眼部感染常見病原體的實時熒光多重pcr快速檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，具體涉及眼部感染常見病原體的實時熒光多重 PCR快速檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 眼睛感染指細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原體侵入人體眼部所引起的局部組織炎 癥反應。最常受到感染的部位包括眼皮、結膜、角膜和鞏膜。最常見的炎癥是結膜炎和眼瞼 炎。
[0003] 感染原因很多，包括不注意眼部衛(wèi)生，用手揉眼睛引起的細菌或病毒感染；被已 感染者直接或間接傳染；灰塵等進入眼睛造成角膜異物也可引發(fā)感染；母嬰傳播也可引起 眼部感染。
[0004] 主要感染病毒有單純皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒、人類免疫缺陷病 毒、腺病毒和腸道病毒等。由于眼部感染有可能直接影響患者視力，并且其他原因，如過敏 反應或眼部刺激等也可造成與感染相似的癥狀，因此通過病原體檢測及時確診眼部感染就 顯得尤為重要。
[0005] 病毒分離培養(yǎng)是最特異的診斷方法，培養(yǎng)后應用酶免疫法或核酸探針技術檢測培 養(yǎng)物上清液中的反轉(zhuǎn)錄酶活性或檢測病毒抗原，但病毒的分離培養(yǎng)需在特定的實驗室中進 行，且敏感性較低；電鏡觀察法實施較為方便，但是可檢測病原體種類較少，并且價格昂貴； 血清學檢查，操作比較繁瑣；免疫熒光技術敏感性和特異性均較高，但是結果判讀的主觀性 較強且需要使用熒光顯微鏡；熒光核酸PCR技術具有敏感性高，檢測快速等優(yōu)點，預期將會 在臨床診斷中有廣泛的應用。然而，傳統(tǒng)的熒光實時PCR每次只能擴增一種病原體的核酸， 要準確找出致病病原體需多次嘗試，耗費大量的時間和精力，并且對于多種病原體導致的 感染無法有效區(qū)分。新型的多重實時熒光PCR可以有效彌補單重PCR的這些缺陷，是一種 非常有應用前景的診斷方法。
[0006] 要成功實施多重PCR，需要解決幾個技術問題：①由于每一種擴增子的最佳擴增 條件都不一樣，需要協(xié)調(diào)每個單獨反應的條件以保證在單一擴增條件下各擴增子都能進行 成功擴增。@由于需要使用多組引物/探針組合，不同引物/探針之間互相產(chǎn)生交聯(lián)的可 能性很大，因此在設計時需要考慮消除這一可能性。@每組引物/探針不能對其他目標和 非目標核酸序列有交叉同源性，以防止產(chǎn)生假陽性的結果，影響對疾病的診斷。?需要有 一定的方法來排除來自于核酸提取方面的問題，這就要求有內(nèi)對照作為參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是解決不同引物/探針之間互相產(chǎn)生交聯(lián)的問題，提供眼部感染常 見病原體的實時熒光多重PCR快速檢測試劑盒，能夠快速、準確的進行檢測。
[0008] 本發(fā)明為解決上述問題所采取的技術方案是：眼部感染常見病原體的實時熒光多 重PCR快速檢測試劑盒，試劑盒內(nèi)設有陽性對照、陰性對照和內(nèi)對照，該試劑盒內(nèi)還設有分 別用于檢測單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、帶狀皰疹病毒、腺病毒和沙眼衣原體中 一種或多種病原體的多種引物及探針序列的混合物，其中，用于單純皰疹病毒1型檢測的 引物序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :3,熒光 標記為FAM ;用于單純皰疹病毒2型檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :6,熒光標記為VIC ;用于帶狀皰疹病毒檢測的引物序列分 別為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8, Taqman探針序列為SEQ ID NO :9,熒光標記為Cy5; 用于腺病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11，Taqman探針序列 為SEQ ID NO :12,熒光標記為Cy5;用于沙眼衣原體檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :13 和SEQ ID NO : 14 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO : 15,熒光標記為ROX ;所述的內(nèi)對照為 鼠巨細胞病毒，用于鼠巨細胞病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :16和SEQ ID NO : 17，Taqman探針序列為SEQ ID NO : 18,熒光標記為YAK。
[0009] 有益效果 本發(fā)明所涉及的檢測試劑盒，避免了不同引物/探針之間互相產(chǎn)生交聯(lián)的問題，每組 引物/探針不會對其他目標和非目標核酸序列產(chǎn)生交叉同源性，可實現(xiàn)一次反應同時檢測 多種引起眼部感染的常見病原體，檢測所需時間短，準確性高，為臨床和檢測實驗室提供了 有力的檢測工具。
【具體實施方式】
[0010] 眼部感染常見病原體的實時熒光多重PCR快速檢測試劑盒，試劑盒內(nèi)設有陽性對 照、陰性對照和內(nèi)對照，該試劑盒內(nèi)還設有分別用于檢測單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒 2型、帶狀皰疹病毒、腺病毒和沙眼衣原體中一種或多種病原體的多種引物及探針序列的混 合物，其中，用于單純皰疹病毒1型檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO : 2 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :3,熒光標記為FAM ;用于單純皰疹病毒2型檢測的引物 序列分別為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :6,熒光標記 為VIC ;用于帶狀皰疹病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8, Taqman 探針序列為SEQ ID NO :9,熒光標記為Cy5;用于腺病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11，Taqman探針序列為SEQ ID NO :12,熒光標記為Cy5;用于沙眼衣 原體檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14，Taqman探針序列為SEQ ID NO :15,熒光標記為ROX ;所述的內(nèi)對照為鼠巨細胞病毒,用于鼠巨細胞病毒檢測的引物 序列分別為SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :18,熒光 標記為YAK。
[0011] 實施例一：檢測單純皰疹病毒1 :使用單純皰疹病毒1陽性對照作為樣本。相應引 物/探針組合及陽性對照的獲得見實施例二。在提取之前先向樣本和陰性對照加入2 μ 1 內(nèi)對照（5 μ Μ)。使用 MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit(Invitrogen)從樣本 中提取核酸。然后向 TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Invitrogen, 13. 5μ I)中 分別加入各引物/探針組合（I. 5 μ I)以及從樣本或陰性對照提取的核酸（10 μ I)。樣 本最終濃度為5 μ M，引物/探針濃度為0.4 μ M。隨后將各反應管按照以下程序在ABI 7500 (Applied Biosystems)實時熒光PCR儀上進行PCR反應：50°C保持15min(逆轉(zhuǎn)錄）， 95°C保持IOmin (熱啟動）；95°C維持8s (變性），60°C維持34s (退火/延伸，采集熒光信 號），40個循環(huán)。結果可檢測到單純皰疹病毒1存在。其余各病原體的檢測與實施例1相 同。
[0012] 實施例二：一次檢測眼科感染5種病原體的檢測試劑盒 1) 設計引物/探針組合：根據(jù)各個病原體的核酸序列，進行同種間的序列比對以尋找 保守區(qū)域，并使用Beacon Designer軟件對這些保守區(qū)域進行多重PCR的引物和Taqman探 針設計。將所得到的各引物/探針組合在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST分析以確保與樣本中可 能存在的其他微生物不發(fā)生交叉反應。最后通過實驗驗證其性能。內(nèi)對照的設計采用同樣 的方法。
[0013] 所設計的各組引物/探針如下： 反應一：含單純皰疫病毒1，2和帶狀皰疫病毒
【主權項】
1.眼部感染常見病原體的實時熒光多重PCR快速檢測試劑盒，試劑盒內(nèi)設有陽性對 照、陰性對照和內(nèi)對照，其特征在于：該試劑盒內(nèi)還設有分別用于檢測單純皰疹病毒1型、 單純皰疹病毒2型、帶狀皰疹病毒、腺病毒和沙眼衣原體中一種或多種病原體的多種引物 及探針序列的混合物，其中，用于單純皰疹病毒1型檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :1 和SEQ ID NO :2 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :3,熒光標記為FAM ;用于單純皰疹病毒 2型檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，Taqman探針序列為SEQ ID NO :6,熒光標記為VIC ;用于帶狀皰疹病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8, Taqman探針序列為SEQ ID NO :9,熒光標記為Cy5;用于腺病毒檢測的引物序列分 別為SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11 ,Taqman探針序列為SEQ ID NO :12,熒光標記為 Cy5;用于沙眼衣原體檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14，Taqman 探針序列為SEQ ID NO :15,熒光標記為ROX ;所述的內(nèi)對照為鼠巨細胞病毒,用于鼠巨細胞 病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17，Taqman探針序列為SEQ ID NO : 18,熒光標記為YAK。
【專利摘要】本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，具體涉及眼部感染常見病原體的實時熒光多重PCR快速檢測試劑盒。本發(fā)明所涉及的檢測試劑盒，避免了不同引物/探針之間互相產(chǎn)生交聯(lián)的問題，每組引物/探針不會對其他目標和非目標核酸序列產(chǎn)生交叉同源性，可實現(xiàn)一次反應同時檢測多種引起眼部感染的常見病原體，檢測所需時間短，準確性高，為臨床和檢測實驗室提供了有力的檢測工具。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68, C12Q1-70
【公開號】CN104561378
【申請?zhí)枴緾N201410815124
【發(fā)明人】賈昕, 張勝楠, 李明, 梁紅, 李科
【申請人】華美生物工程有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月24日