用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的核酸探針、試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測病毒的探針，具體地說，是一種用于檢測青蟹雙順反子病 毒-1的特異性核酸探針、檢測方法以及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 擬穴青蟹隸屬梭子蟹科，青蟹屬，因其肉美味鮮，含有豐富的蛋白質(zhì)及微量元素， 有清熱解毒、補骨添髓、養(yǎng)筋接骨等功效，倍受人們的喜愛，成為我國東南沿海地區(qū)重要的 海水養(yǎng)殖種類。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的逐步擴大，病害問題的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了擬穴青蟹養(yǎng)殖 業(yè)的健康發(fā)展。青蟹雙順反子病毒-l(Mud Crab Dicistrovirus-l，MCDV-l)是在近幾年 的染病青蟹體內(nèi)新分離的一種病原體。感染該病毒后病蟹表現(xiàn)出食欲不振，活力缺乏，人工 感染死亡率100%。該病毒是一種球狀、無囊膜、直徑30nm的單正鏈RNA病毒，能夠通過浸 泡、進食、投喂、共居的方式感染擬穴青蟹，但是至今為止，還沒有有效的治療方法，所以，杜 絕傳染源、防止病毒的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷青蟹雙順反子病 毒-1是減少損失的有效途徑。
[0003] 核酸探針分子雜交技術(shù)是利用帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段和互補的核酸 序列雜交，然后通過抗原-抗體反應(yīng)和酶-底物的化學(xué)顯色反應(yīng)來顯示結(jié)果，可用于待測核 酸樣品中特定基因序列的檢測。將核酸探針應(yīng)用于原位雜交還可以對病毒在組織內(nèi)的分布 進行定位，國內(nèi)已經(jīng)有不少學(xué)者將這項技術(shù)用于臨床檢測以及流行病學(xué)調(diào)查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的核酸探針， 該探針能夠特異性的識別該病毒的核酸序列，可以用于青蟹雙順反子病毒-1的檢測。
[0005] 本發(fā)明的目的還在于提供一種含有上述核酸探針的青蟹雙順反子病毒-1檢測試 劑盒，該試劑盒特異性好，操作簡便，可以對該病毒進行檢測以及組織定位。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述試劑盒檢測青蟹雙順反子病毒-1的斑點 雜交方法，該方法特異性好，對于設(shè)備要求不高，操作簡單。
[0007] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供一種利用上述試劑盒檢測青蟹雙順反子病毒-1 的原位雜交檢測方法，該方法操作容易，特異性好，而且可以對病毒在宿主體內(nèi)的分布進行 定位。
[0008] 本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0009] 該用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的核酸探針為地高辛標(biāo)記的核酸片段，該核酸 片段的5'端和3'端之間的基因序列如SEQID NO. 1所示。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0011] 含上述的用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的核酸探針的試劑盒，其特征在于，所述 的試劑盒由多個試劑瓶和硝酸纖維素膜組成，所述的試劑瓶包括下述組分，用于檢測青蟹 雙順反子病毒-1核酸的A液，用于促進探針結(jié)合的B液，用于消化包圍靶RNA蛋白質(zhì)的C 液，用于組織蛋白非特異結(jié)合位點封閉的D液，用于與沒有雜交的探針結(jié)合的E液，用于顯 色的F液，用于洗去雜質(zhì)的G液；
[0012] 其中：所述的A液為地高辛標(biāo)記的核酸探針。
[0013] 上述的試劑盒，所述的B液為雜交液；所述的C液為蛋白酶K ;所述的D液為IOX 封閉液；所述的E液為堿磷酶標(biāo)記的地高辛抗體；所述的F液NBT/BCIP儲液；所述的G液 為TE緩沖液。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0015] 1)將NC膜用2 X SSC液浸透，取出后晾干；
[0016] 2)將病毒樣品RNA放PCR儀中變性后，立即放入冰上；
[0017] 3)將變性后的病毒RNA點樣于步驟1)的NC膜上，120°C烤膜30min ;
[0018] 4)將步驟3)烤后的NC膜放入B液中預(yù)雜交30min ;
[0019] 5)用B液將A液稀釋至25ng/mL后煮沸變性，立即置于冰上冷卻；
[0020] 6)將步驟4)預(yù)雜交好的NC膜轉(zhuǎn)移到步驟5)中制備的探針雜交液中，孵育過夜；
[0021] 7)將步驟6)雜交好的NC膜在室溫下清洗，再用緩沖液中漂洗；
[0022] 8)將D液用馬來酸緩沖液稀釋后制成封閉溶液工作液，將NC膜放入封閉溶液，靜 置；
[0023] 9)用步驟8)的封閉溶液工作液將E液稀釋后，制成抗體溶液工作液，然后將NC膜 放入抗體溶液工作液中，靜置；
[0024] 10)將步驟9)的NC膜放入洗滌緩沖液中洗滌后放入檢測緩沖液中平衡；
[0025] 11)向F儲液加入檢測緩沖液中混勻制備底物顯色液，然后滴加在NC膜上中避光 顯色過夜；顯色后用G液洗NC膜，結(jié)果掃描或拍照。
[0026] 本發(fā)明的第四個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0027] 用上述試劑盒檢測青蟹雙順反子病毒-1的原位雜交方法，該方法依次包括下述 步驟：
[0028] 1)組織切片上滴加 C液，37°C消化20min ;PBS漂洗后，用多聚甲醛液固定后漂洗；
[0029] 2)將玻片用變性液78°C變性8min，立即放入-20°C預(yù)冷的乙醇梯度中；
[0030] 3)用B液將A液稀釋后滴加在步驟2)完全風(fēng)干后的玻片上，雜交過夜；
[0031] 4)漂洗步驟3)的玻片；
[0032] 5)將D液用馬來酸緩沖液稀釋后制成封閉溶液工作液，滴加在步驟4)的玻片上靜 置；
[0033] 6)用封閉溶液工作液將E液稀釋，制成抗體溶液工作液，然后滴加到步驟5)處理 后的玻片上，靜置；
[0034] 7)將步驟6)玻片放入洗滌緩沖液中漂洗后放入檢測緩沖液中平衡；
[0035] 8)向F液加入檢測緩沖液中混勻制備底物顯色液，將步驟7)的玻片放入底物顯色 液中避光顯色；
[0036] 9)用G液浸泡步驟8)的玻片后復(fù)染，再次洗滌后快速脫水透明，中性樹膠封片，光 鏡下觀察。
[0037] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0038] 本發(fā)明根據(jù)青蟹雙順反子病毒-1的基因序列，設(shè)計合成了一條特異性的地高辛 標(biāo)記的核苷酸探針，并利用探針建立了青蟹雙順反子病毒-1的斑點雜交檢測方法和原位 雜交檢測方法，并對