多特異單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多特異性抗體的產(chǎn)生，該抗體的特征在于，其以特異性和親和性與多 個(gè)抗原結(jié)合的能力。尤其是，本發(fā)明涉及雙特異性抗體。本發(fā)明還涉及結(jié)合一個(gè)以上靶標(biāo) 的其他多特異蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 雖然眾所周知，低親和性（大約>luM)抗體通常結(jié)合多個(gè)抗原，但是通常將天然和 人工的親和性成熟和優(yōu)化方法（定向演化或者分子演化）設(shè)計(jì)成增加僅僅針對處于高親和 性的分子的單個(gè)表位的親和性和特異性。通常，對于大部分應(yīng)用，特異性是重要的特性；例 如，在治療學(xué)中特異性可以防止可能降低分子的安全性的脫靶效應(yīng)。然而，結(jié)合有限數(shù)量 (例如2、3、4、5、6、7、8、9或者10,但是優(yōu)選2或者3)的選定的靶抗原的能力具有實(shí)質(zhì)的用 途，尤其是例如用于治療其中存在多個(gè)活化路徑的疾病，諸如與癌癥相關(guān)的疾病。定期用單 克隆抗體對癌癥進(jìn)行免疫治療，并不激活T-細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儾槐磉_(dá)Fc-受體。雙特異性抗 體（一條臂結(jié)合腫瘤標(biāo)志物，一條臂結(jié)合T-細(xì)胞特異表面抗原，例如CD3)可以克服該問題 并且連接腫瘤細(xì)胞和T-細(xì)胞。另外，三功能性抗體（具有2種不同的結(jié)合特異性和完整Fc 結(jié)構(gòu)域的IgG)還可以結(jié)合至Fc受體表達(dá)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。然后腫瘤細(xì)胞被 連接至免疫系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，該免疫系統(tǒng)隨后消滅腫瘤細(xì)胞。
[0003] 數(shù)個(gè)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)嘗試設(shè)計(jì)雙特異性抗體，例如通過雙硫鍵還原拆分兩個(gè)獨(dú)立的抗體 的抗體重鏈，然后在氧化環(huán)境下再聚集抗體來制造異源抗體，從而Fab的二價(jià)IgG分子不同 并且結(jié)合至單獨(dú)的抗原。該方法的缺點(diǎn)在于對相同的目標(biāo)分子無親合力，并且?guī)沓杀靖?的產(chǎn)品生產(chǎn)及純化過程。也開發(fā)了其他方案，其包括Fab內(nèi)的序列擴(kuò)增，有效地復(fù)制抗體上 的抗原結(jié)合口袋，從而每個(gè)結(jié)合口袋可以具有對單個(gè)抗體分子的不同抗原特異性。雖然這 簡化了生產(chǎn)和純化，但是該結(jié)構(gòu)對于人體是外來的并且存在刺激患者內(nèi)的負(fù)免疫反應(yīng)的風(fēng) 險(xiǎn)。其他團(tuán)隊(duì)利用新穎的共價(jià)連接以實(shí)現(xiàn)多表位結(jié)合，從而產(chǎn)生"抗體類"分子。
[0004] 可能難以生產(chǎn)傳統(tǒng)的雙特異或者多特異性抗體。例如，通過表達(dá)同一細(xì)胞中的兩 個(gè)單獨(dú)的重鏈和兩個(gè)單獨(dú)的輕鏈可以構(gòu)建這些抗體（Quadroma technology，Milstein et al，1983)，然而，該方法存在問題，因?yàn)槌似谕妮p鏈1/重鏈1-重鏈2/輕鏈2異二聚 體，將總共形成10個(gè)可能的重鏈和輕鏈組合（Suresh et al.，1986)。多余的輕鏈/重鏈配 對的結(jié)合親和性和特異性是未知的。為了降低得到的種群的可能的輕鏈/重鏈組裝的復(fù)雜 性作出的努力包括諸如"件白"設(shè)計(jì)（"knob in hole"design, Ridgeway et al.，1996,通 過引用并入本文）的方法，其中可以修飾重鏈的Fc部分以消除一些同源二聚體的形成。然 而，即便是有這些改變，利用傳統(tǒng)技術(shù)該種群仍然復(fù)雜。期望的雙特異（或者多特異）產(chǎn)物 只是混合物的一小部分，使得雙特異（多特異）抗體的純化困難并且有時(shí)在許多情況下以 商業(yè)規(guī)模是不可取的。
[0005] 本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于其以特異性和親和性（例如，<10nM)結(jié)合至多 個(gè)抗原的能力。在一個(gè)方面，本發(fā)明的多特異性抗體包含兩個(gè)不同的重鏈可變結(jié)構(gòu)域（結(jié) 合兩個(gè)或以上的不同抗原）、匹配兩個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域或者已經(jīng)被優(yōu)化以匹配兩個(gè)重鏈的 單個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、以及形成異源二聚體或者已經(jīng)被優(yōu)化以形成異源二聚體的Fc。可以 以若干途徑實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的多特異性抗體的構(gòu)建。例如，在一種途徑中，利用若干方法（包括 本文描述的方法）中的其中一種演化兩個(gè)親本單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域，從而同一單條輕 鏈可以在功能上補(bǔ)充來自親本抗體的兩條重鏈。還可以演化單個(gè)親本抗體的重鏈，從而其 可以結(jié)合第二靶標(biāo)，產(chǎn)生新的重鏈，隨后用來自親本抗體的輕鏈配對新的重鏈。在又一途徑 中，可以演化單個(gè)親本抗體的輕鏈，從而其可以結(jié)合第二靶標(biāo)，產(chǎn)生新的輕鏈，然后用來自 親本抗體的重鏈配對新的輕鏈。采用"杵白"型途徑或者促使Fc形成或者導(dǎo)致Fc形成異 源二聚體的任何其他途徑，可以產(chǎn)生形成本發(fā)明的多特異性抗體的異源二聚體的Fc部分。
[0006] 本文進(jìn)一步描述了構(gòu)建本發(fā)明的多特異性抗體的實(shí)例。
[0007] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在分離本發(fā)明的多特異性抗體之后，通過演化方法可以 進(jìn)一步改善多特異性抗體與一個(gè)或多個(gè)抗原或者靶標(biāo)的親和性，例如綜合演化方法 (comprehensive evolution process)。在綜合演化方法的一個(gè)方面中，在篩選期間鑒別高 表達(dá)突變體（up-mutant)，因?yàn)檫@些突變體改善與至少一個(gè)或兩個(gè)抗原的結(jié)合而不會(huì)導(dǎo)致 降低與其中任一抗原的結(jié)合。然后可以進(jìn)一步例如組合地混合和匹配這些高表達(dá)突變體 (改變可以位于重鏈和/或輕鏈內(nèi)）。
[0008] 在某些其他例子中，期望與其中一個(gè)靶抗原的較低親和性和與另一靶抗原的較高 親和性。例如，Y. Joy Yu等在Science Translational Medicine, 25May 2011，Vol 3, Issue 8484ra44,"Boosting Brain Uptake of a Therapeutic Antibody by Reducing Its Affinity for a Transcytosis Target"上發(fā)表了一種雙特異性抗體，其具有包含低親和性 抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體的一條臂和包括高親和性BACE1抗體的另一條臂，該雙特異性抗體能 夠穿過血腦屏障并且在小鼠腦中達(dá)到治療濃度。與親本單特異抗體相比，該雙特異性抗體 有效得多。
[0009] 因此，在綜合演化方法的另一方面中，在篩選期間鑒別高表達(dá)突變體，因?yàn)槟切┩?變體改善與一個(gè)抗原的結(jié)合。雖然不優(yōu)選導(dǎo)致與第二抗原的結(jié)合親和性降低的突變體，但 是這些突變體在以組合方法在突變組合方法期間與其他突變組合時(shí)失去抑制效應(yīng)的情況 下是有用的?；诤蜻x物的整體親和性以及其各自的與每一所選抗原的抗原：抗體結(jié)合的 打開和關(guān)閉率（on and off rate)，可以實(shí)施篩選以鑒別最重要的候選物。
[0010] 還可以優(yōu)化本發(fā)明的多特異性抗體，以增加或者降低在其他條件中的活性或者穩(wěn) 定性，諸如PH、氧化、溫度、壓力或者不同的離子濃度。
[0011] 附圖簡要說明
[0012] 圖1示出本發(fā)明的H2L抗體的一個(gè)實(shí)施方案。H2L抗體具有優(yōu)化的可變結(jié)構(gòu)域，其 允許同一輕鏈與來自2個(gè)不同的親本抗體（抗體1和抗體2)的2條重鏈中的每一條組裝 而不改變對于特定抗原的結(jié)合特異性。輕鏈與來自抗體1的重鏈1組裝而形成結(jié)合抗原1 的"Fab-臂1-H2L"。同一輕鏈還與來自抗體2的重鏈2組裝而形成結(jié)合抗原2的"Fab-臂 2-H2L"。以只允許HC1-HC2二聚體在體內(nèi)形成的方式修飾重鏈的Fc部分（例如，在本實(shí)例 中通過"杵白"設(shè)計(jì)促進(jìn)，并且標(biāo)記成Fc異源二聚體）。只形成異源二聚體的2條重鏈和單 條輕鏈的表達(dá)導(dǎo)致僅僅形成單一產(chǎn)物，即本發(fā)明的"H2L mAb"抗體。產(chǎn)生的每個(gè)分子具有 結(jié)合抗原1的一條Fab臂和結(jié)合抗原2的另一條Fab臂。可以類似于普通的IgG -樣生產(chǎn) 和純化H2L mAb。
[0013] 圖2示出篩選排列的人類免疫球蛋白輕鏈文庫的實(shí)例。用重鏈HC1和完全的人輕 鏈（不同的輕鏈位于每個(gè)孔中）組成的重組IgG孵育微量滴定板中固定的抗原靶標(biāo)A。在 用抗人IgG-HRP綴合物清洗后檢測結(jié)合的抗體。每個(gè)柱代表一獨(dú)特的克隆。水平的黑線 表示背景活性；水平的虛線表示2x背景。將具有2x背景之上的信號的克隆作為主要標(biāo)的 (primary hits)計(jì)數(shù)。X軸代表孔位置；y軸代表(?45(|值。
[0014] 圖2示出雙特異H2L mAb與兩個(gè)靶抗原的結(jié)合的ELISA數(shù)據(jù)。用靶標(biāo)A(灰柱）或 者靶標(biāo)B (黑柱）涂覆微量滴定板的孔。與野生型輕鏈wtLCl或者新型輕鏈LC-1OT10組合 的重鏈1 (HC1)結(jié)合靶標(biāo)A而不結(jié)合靶標(biāo)B，而與野生型輕鏈wtLC2或者新型輕鏈LC-1OT10 組合的HC2結(jié)合靶標(biāo)B。由HC1、HC2和新型輕鏈LC-MDIO組成的雙特異H2L mAb結(jié)合靶 標(biāo)A和靶標(biāo)B兩者。X軸代表克隆名稱。Y軸代表0D45(I值。
[0015] 術(shù)語定義
[0016] 為了有助于理解本文提供的實(shí)例，將說明某些頻繁出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
[0017] 本文使用的術(shù)語"氨基酸"是指包含氨基基團(tuán)（_NH2)和羧基基團(tuán)（-C00H)的任 何有機(jī)化合物；優(yōu)選作為自由基團(tuán)，或者可選地，在縮合之后作為鈦鍵的一部分。"20個(gè)天 然編碼的形成多肽的a -氨基酸"按照本領(lǐng)域的理解并且是指：丙氨酸（ala或A)、精氨酸 (arg或R)、天門冬酰胺（asn或N)、天冬氨酸（asp或D)、半胱氨酸（cys或C)、谷氨酸（glu 或E)、谷氨酰胺（gin或Q)、甘氨酸（gly或G)、組氨酸（his或H)、異亮氨酸（ile或I)、亮 氨酸（leu或L)、賴氨酸（lys或K)、蛋氨酸（met或M)、苯丙氨酸（phe或F)、脯氨酸（pro 或P)、絲氨酸（ser或S)、蘇氨酸（thr或T)、色氨酸（trp或W)、酪氨酸（tyr或Y)以及纈 氨酸（val或V)。
[0018] 術(shù)語"擴(kuò)增"表示，多核苷酸的拷貝數(shù)量增加。
[0019] 本文使用的術(shù)語"抗體"是指完整的免疫球蛋白質(zhì)分子（包括IgM、IgD、IgG、IgE 以及IgA同種型）以及免疫球蛋白質(zhì)分子的能夠結(jié)合抗原表位的片段，諸如Fab、Fab'、 (Fab'）2以及Fv片段。利用本領(lǐng)域公知的方法（參見例如Harlow and Lane,同上）可 以制作這些抗體片段，這些抗體片段保留一些能力以選擇性地結(jié)合至其衍生自的抗體的抗 原，以下進(jìn)一步說明這些抗體片段。
[0020] (l)Fab片段由抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段組成，并且該Fab片段可以通過木瓜 蛋白酶消化整個(gè)抗體分子以產(chǎn)生由完整的輕鏈和一部分重鏈組成的片段而產(chǎn)生。
[0021] (2)用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體分子，然后還原，從而產(chǎn)生由完整的輕鏈和一部分重 鏈組成的分子，可以獲得抗體分子的Fab'片段。每一以該方式處理的抗體分子，獲得兩個(gè) Fab'片段。
[0022] (3)用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體分子而不進(jìn)行隨后的還原可以獲得抗體的（Fab)' 2 片段。（Fab)'2片段是兩個(gè)Fab'片段通過兩個(gè)二硫醚鍵連接在一起的二聚體。
[0023] (4)將Fv片段定義成包含表達(dá)為兩條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程 片段。
[0024] 具有"嵌合"性質(zhì)的分子是以下分子：1)與第一對照分子部分同源且部分異源；而 2)同時(shí)與第二對照分子部分同源且部分異源；而沒有3)排除同時(shí)與一個(gè)或多個(gè)其他的對 照分子部分同源且部分異源的可能性。在非限制性實(shí)施方案中，通過組織部分分子序列的 重排可以制備嵌合分子。在非限制方面中，通過利用多個(gè)分子模板合成嵌合多核苷酸，可以 制備嵌合多核苷酸分子，從而使得得到的嵌合多核苷酸具有多個(gè)模板的性能。
[0025] 本文使用的"比較窗口"是指連續(xù)的核苷酸位置的概念段，例如20個(gè)或者更多的 連續(xù)的核苷酸位置，其中，多核苷酸序列可以與至少相同數(shù)量的連續(xù)核苷酸的對照序列相 比，以及其中，比較窗口中的多核苷酸序列的部分與對照序列（其不包含添加或者缺失）相 比，可以包括20%或更少的添增或者缺失（即缺口），用于兩條序列的最佳比對。用于比 對比較窗口的最佳序列比對，可以通過以下方式來進(jìn)行：Smith and Waterman(1981)Adv. Appl. Math. 2:482 的局部同源性算法、Needlemen and Wuncsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 的同源性比對算法、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S. A. )85:2444(1988) 的相似法搜索、這些算法（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 中的GAP、 BESTFIT、FASTA、以及 TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Dr. , Madison, ffis.) 的計(jì)算機(jī)實(shí)施或者通過檢查，并且選擇由各種方法產(chǎn)生的最佳比對（即導(dǎo)致比較窗口上的 最高百分比的同源性）。
[0026] 本文所使用的術(shù)語"互補(bǔ)性決定區(qū)"和"⑶R"是指Kabat和Chothia例證的本領(lǐng)域 公認(rèn)的術(shù)語。⑶R定義也通常公知為超變區(qū)或者高變環(huán)（Chothia and Leks，1987 ;Clothia et al.，1989 ;Kabat et al, 1987 ;以及 Tramontane) et al.，1990)?？勺儏^(qū)結(jié)構(gòu)域通常 包含天然存在的免疫球蛋白鏈的氨基端大約105-115個(gè)氨基酸（例如，氨基酸1-110)，但 是稍微短些或者長些的可變結(jié)構(gòu)域也適合用于形成單鏈抗體。CDR是決定免疫球蛋白分 子的特異性并且與特異性配體接觸的所述免疫球蛋白的一部分。CDR是所述分子最可變 的部分并且促成這些分子的多樣性。在每個(gè)V結(jié)構(gòu)域中存在三個(gè)⑶R區(qū)即⑶R1、⑶R2和 ⑶R3。⑶R-H描述可變重鏈的⑶R區(qū)，并且⑶R-L與可變輕鏈的⑶R區(qū)相關(guān)。H表示可變重 鏈而 L 表不可變輕鏈。可以如 Kabat (1991) .Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edit. , NIH Publication no. 91-3242U. S. Department of Health and Human Services,Chothia(1987).J.Mol.Biol.l96,901-917 以及 Chothia(1989) Nature, 342, 877-883中所述，確定Ig-衍生區(qū)的CDR區(qū)。
[0027] "保守氨基酸取代"是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈 的氨基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸 組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè) 鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組是賴氨酸、精氨酸和 組氨酸；以及具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是： 纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，以及天 冬酰胺_谷氨酰胺。
[0028] 本文使用的術(shù)語"去免疫"與產(chǎn)生模板結(jié)合分子的變體相關(guān)，通過使得所述變體相 對于原始野生型分子在人體中是非免疫原性的或者免疫原性較小，而修飾所述模板結(jié)合分 子。本發(fā)明的去免疫分子與非人類來源的抗體或其部分（如框架和/或CDR)相關(guān)。相應(yīng) 的實(shí)例是如US 4361549中所描述的抗體或其片段。術(shù)語"去免疫"也與表現(xiàn)出產(chǎn)生T細(xì)胞 表位的傾向降低的分子相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向降低"與導(dǎo)致特異 T-細(xì)胞激活的T-細(xì)胞表位的去除相關(guān)。
[0029] 另外，產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向降低，表示促成T細(xì)胞表位形成的氨基酸的取代，即 對于形成T細(xì)胞表位是必要的氨基酸的取代。換句話說，產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向降低與免 疫原性降低或者誘導(dǎo)抗原獨(dú)立性T細(xì)胞增殖的能力降低相關(guān)。另外，產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾 向降低與去免疫相關(guān)，其意味著誘導(dǎo)抗原獨(dú)立性T細(xì)胞增殖的氨基酸序列的潛在T細(xì)胞表 位的損失或者減少。
[0030] 本文使用的術(shù)語"T細(xì)胞表位"指可以在細(xì)胞內(nèi)的肽、多肽或者蛋白質(zhì)的降解期間 釋放并且隨后由主要組織相容性復(fù)合體（MHC)的分子呈遞以便引發(fā)T細(xì)胞的激活的短肽序 列；尤其是參見WO 02/066514。對于由II類MHC呈遞的肽，然后T細(xì)胞的這種激活可以通 過B細(xì)胞的直接刺激誘發(fā)抗體響應(yīng)，從而產(chǎn)生所述抗體。
[0031] DNA的"消化"是指利用只在DNA中的特定序列處發(fā)揮作用的限制性內(nèi)切酶催化 切割DNA。本文使用的各種限制性內(nèi)切酶是可商購的，并且其反應(yīng)條件、輔因子和其他需求 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知地使用。對于分析目的，通常1 U g的質(zhì)?；蛘逥NA片段與約 20 yl的緩沖溶液中的約2個(gè)單位的酶一起使用。出于分離DNA片段以便構(gòu)建質(zhì)粒的目的， 通常用更大體積的20-250單位的酶消化5-50 y g的DNA。特定的限制性內(nèi)切酶的合適的緩 沖液和底物量由制造商指定。在37°C下通常使用約1小時(shí)的孵育時(shí)間，但是可以根據(jù)供應(yīng) 商的指示改變。在消化之后，直接在凝膠上電泳該反應(yīng)物以分離期望的片段。
[0032] 如本文所使用的，術(shù)語"表位"是指與抗體的抗體結(jié)合部位結(jié)合的抗原上的抗原決 定簇。抗原決定簇通常由化學(xué)活性表面分子組組成，諸如氨基酸或者糖側(cè)鏈，并且可以具有 特異的三維結(jié)構(gòu)特性，以及特異的電荷特性。本文使用的"表位"是指抗原或者能夠形成結(jié) 合相互作用的其他大分子的、與抗體的可變區(qū)結(jié)合體相互作用的部分。通常，這種結(jié)合相互 作用顯示為與CDR的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的分子間接觸。
[0033] 如本文所使用的，術(shù)語"演化"是指定向演化或者分子演化的方法，其是為了期望 的性質(zhì)通過實(shí)驗(yàn)修飾生物分子的方法，并且可以通過誘變一個(gè)或者多個(gè)親本分子模板和在 后代分子中鑒別任何期望的分子來實(shí)現(xiàn)；許多演化方法（定向演化）是本領(lǐng)域公知和發(fā)表 的，包括定點(diǎn)誘變、易錯(cuò)PCR、位點(diǎn)飽和法、以及其他隨機(jī)和非隨機(jī)的方法。本發(fā)明的方法可 以使用這些方法中的任何方法。
[0034] 當(dāng)提及對照多肽時(shí)，術(shù)語"片段"、"衍生物"和"類似物"包括保留至少一種與對照 多肽的生物功能或者活性至少基本上相同的生物功能或者活性的多肽。另外，術(shù)語"片段"、 "衍生物"或者"同源物"的實(shí)例是"原形式（pro-form) "分子，諸如可以通過切割修飾以產(chǎn) 生具有顯著更高活性的成熟酶的低活性前蛋白（proprotein)。
[0035] 本文提供從模板多肽產(chǎn)生一組后代多肽的方法，在該組后代多肽中，每個(gè)氨基酸 位置處表示"全范圍的單氨基酸取代"。本文所使用的"全范圍的單氨基酸取代"是涉及天 然編碼的20種天然編碼的形成多肽