用于生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌抗原的方法
【專利說明】用于生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌抗原的方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌（Hib)的莢膜多糖的方法， 根據(jù)所述方法，將Hib的菌株在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基的組成是在化學(xué)上進行定 義的，且因此不包含任何復(fù)雜的氮源或碳源。
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)，具體而言申請W2009007641，描述了用于b型流感嗜血桿菌的改進培養(yǎng) 基，其不包含任何來自動物源的要素，如當(dāng)培養(yǎng)b型流感嗜血桿菌的目的在于產(chǎn)生將隨后 作為抗原引入疫苗組合物的莢膜多糖時所推薦。在該現(xiàn)有技術(shù)中描述的培養(yǎng)基中，用植物 蛋白胨代替通常由動物蛋白胨組成的氮源。
[0003] 此類培養(yǎng)基在藥物產(chǎn)品的安全性方面而言代表了很大進展，特別是關(guān)于消除了疾 病諸如牛海綿狀腦炎傳播的風(fēng)險；因此，它們允許符合衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)的推薦。
[0004] 然而，蛋白胨的組成可以根據(jù)所提供的批次而變化，這可以導(dǎo)致產(chǎn)生的細菌量和 還有有用抗原的產(chǎn)量的變化，這是疫苗生產(chǎn)者試圖通過改變在方法的實施過程中的某些參 數(shù)來限制或校正的。然而，在藥物產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)的背景下，期望能夠具有可用的穩(wěn)健方 法，其需要在每次實施時盡可能少的改變，并且其在每個步驟的結(jié)果在批次間是可再現(xiàn)的。
[0005] 此類方法還必須允許產(chǎn)率與工業(yè)盈利相容，在從細菌產(chǎn)生抗原的情況下，標(biāo)準(zhǔn)不 僅僅是僅獲得最大可能量的細菌，而且獲得抗原滴度和產(chǎn)生的細菌量之間的最佳比率；其 因此對于在向著產(chǎn)生莢膜多糖引導(dǎo)細菌的代謝的條件下培養(yǎng)的細菌是期望的。
[0006] 為此，本發(fā)明的主題是用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血 桿菌type b)的莢膜多糖（PRP)的方法，根據(jù)所述方法，將b型 流感嗜血桿菌（Hib)的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲該培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便 從其提取莢膜多糖，所述培養(yǎng)基包含至少： -一種碳源， -原卟啉， -鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， -PH調(diào)節(jié)手段， 其特征在于所述培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的。
[0007] 憑借本發(fā)明，通過能夠具有穩(wěn)健的工業(yè)方法，提高莢膜多糖的產(chǎn)率，而不必相應(yīng)地 增加生物量，由此使得可能相對于所生產(chǎn)的PRP量降低產(chǎn)生的脂多糖（LPS)的量。
[0008] 此外，培養(yǎng)基組成中不存在蛋白降低了所需的消泡劑產(chǎn)品方面的需求，且簡化了 純化步驟，這使得可能從培養(yǎng)上清液獲得由莢膜多糖組成的抗原。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基包含pH調(diào)節(jié)手段。這些pH調(diào)節(jié)手段可以由緩沖鹽和/ 或與用于將酸或堿添加至培養(yǎng)基的裝置組合的PH測量裝置組成。借助于pH的調(diào)節(jié)，產(chǎn)率 可以進行優(yōu)化。
[0010] 根據(jù)一個實施方案，根據(jù)本發(fā)明的方法還在于將產(chǎn)生的PRP綴合至載體蛋白，諸 如破傷風(fēng)蛋白。
[0011] 本發(fā)明的一個主題還是用于制備疫苗組合物的方法，根據(jù)所述方法： -通過于在化學(xué)上確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hib的菌株在工業(yè)規(guī)模上制備由莢膜多糖 (PRP)組成的針對b型流感嗜血桿菌（Hib)的抗原，所述培養(yǎng)基的每種成分的性質(zhì)和量是完 全確定的，且包含至少： -一種碳源， -原卟啉， -鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， -以及PH調(diào)節(jié)手段， -收獲培養(yǎng)上清液，和處理該培養(yǎng)上清液以便由其提取純化的莢膜多糖， -將莢膜多糖綴合至載體蛋白。
[0012] 根據(jù)一個實施方案，還將獲得的綴合物與意欲用于針對以下感染中的一種或多 種的接種的至少一種或多種抗原組合：白喉、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎、乙型肝炎、水痘、腮腺 炎、風(fēng)疫、由腦膜炎奈瑟氏菌（Afci1S1Seria iit/is)或肺炎鏈球菌（Sire/?iOcoccw1S 引起的感染、由輪狀病毒引起的感染，以便獲得允許針對數(shù)種疾病同時免疫的 疫苗組合。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的，即每種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和還有量是已知 的。此類培養(yǎng)基不含復(fù)雜的氮源或碳源，諸如蛋白胨、酪蛋白、血清等，并且可以因此，如果 需要，保證不含任何直接源自動物的要素。
[0014] 本發(fā)明涉及用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)b型流感嗜血桿菌的莢膜多糖的方法。此類方 法使得可能獲得與工業(yè)約束相容的生物量和莢膜多糖或PRP的產(chǎn)率。此類方法使得特別 可能從在其遺傳密碼中具有至少2個拷貝的基因座（編碼實現(xiàn)莢膜合成的功能）的b 型流感嗜血桿菌的菌株，在培養(yǎng)12小時后獲得對應(yīng)于至少2. 4的694 nm的D. 0.的生物 量和至少240 mg/升培養(yǎng)基的PRP的相關(guān)量的PRP，而不用特定調(diào)節(jié)培養(yǎng)基（諸如pH或 P〇2)。產(chǎn)生的PRP的量的確定通過高效陰離子交換色譜法與脈沖安培檢測器（HPAEC-PAD) (Dionex)聯(lián)用的技術(shù)，或給出等同結(jié)果的方法來測量。有利地，根據(jù)本發(fā)明的方法使得獲得 至少270 mg/升培養(yǎng)基的PRP的量，甚至更有利地至少300 mg/升的量。
[0015] 在可能的碳源中，可以提到所有可以由b型流感嗜血桿菌的菌株代謝的碳源，特 別是：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、巖藻糖、唾液酸和乳酸。還可以使用2種或更 多種不同的源，特別是乳酸和葡萄糖。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，在起始培養(yǎng)基中存在的葡萄糖的量為5和25 g/Ι之間，更特別是10 至20 g/Ι，且更特別是12至16 g/1。
[0017] 起始培養(yǎng)基中存在的乳酸的量可以是0和15 g/1之間，更特別是0. 5至10 g/1。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，培養(yǎng)基的原Π 卜啉是合成的原Π 卜啉，例如由 Sigma-Aldrich公司以編號258385 (原卟啉二鈉鹽）提供的原卟啉。因此，可以使用可保證 是完全不含動物來源的物質(zhì)的培養(yǎng)基?；蛘?，使用合成的原卟啉IX，其式如下：
【主權(quán)項】
1. 用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血桿菌（ 的莢膜多糖（PRP)的方法，根據(jù)所述方法，將b型流感嗜血桿菌（Hib)的菌株 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便從其提取莢膜多糖，所述培養(yǎng)基 包含至少： -一種碳源， -原卟啉， _鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， _ pH調(diào)節(jié)手段， 其特征在于所述培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的。
2. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基至少包含鋅。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述pH調(diào)節(jié)手段由緩沖鹽組成。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述碳源可以是多重的且選自：葡 萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、巖藻糖、唾液酸和乳酸。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述原卟啉是合成的原卟啉IX。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述鹽選自鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、鈣鹽、 鐵鹽、鋅鹽、鈷鹽和錳鹽。
7. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述鹽選自：K 2HP04;KH 2P04;MgS0 4. 7 H20 ; Na2HP04. 12H20 ；NaH2P04. 2H20 ；CaCl2. 2H20 ；FeS04. 7H20 ；ZnS04. 7H20 ；CoCl2. 6 H20 ；MnS04. H20〇
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述氨基酸選自： 籲精氨酸， 籲丙氨酸， ?以下中的至少一種：天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸， 籲賴氨酸， ?組氨酸， ?色氨酸， 籲纈氨酸， 籲異亮氨酸， 籲亮氨酸， ?酪氨酸， 籲苯丙氨酸， ?胱氨酸或等效物。
9. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基至少包含精氨酸、丙氨酸、組氨 酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于用谷胱甘肽或半胱氨酸替代胱氨 酸。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述維生素選自：硫胺素、泛酸 鹽、尿嘧啶、次黃嘌呤、生物素、核黃素和吡哆醇。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于用瓜氨酸替代精氨酸和尿嘧啶。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于其還包括將獲得的莢膜多糖綴合 至載體蛋白的步驟。
14. 根據(jù)前一權(quán)利要求的方法，其特征在于所述載體蛋白是破傷風(fēng)類毒素。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的獲得的莢膜多糖用于制備疫苗組合物的用途。
16. 用于制備疫苗組合物的方法，根據(jù)所述方法： -a)通過于在化學(xué)上確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hib的菌株在工業(yè)規(guī)模上制備由莢膜多糖 (PRP)組成的針對b型流感嗜血桿菌（Hib)的抗原，所述培養(yǎng)基的每種成分的性質(zhì)和量是完 全確定的，且包含至少： -一種碳源， -原卟啉， -鹽， -氨基酸， -NAD 或 NADH， -維生素， -以及pH調(diào)節(jié)手段， _ b)收獲該培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便由其提取純化的莢膜多糖， -c)將步驟b)中獲得的莢膜多糖綴合至載體蛋白， -d)將步驟c)中獲得的綴合物與用于針對以下感染中的一種或多種的接種的至少一 種或多種抗原組合：白喉、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎、乙型肝炎、水痘、腮腺炎、風(fēng)疹、由腦膜炎奈 瑟氏菌（Afcisseria )或肺炎鏈球菌引起的感 染、由輪狀病毒引起的感染，以便獲得允許針對數(shù)種疾病同時免疫的疫苗組合。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)用于疫苗目的b型流感嗜血桿菌的莢膜多糖(PRP)的方法，根據(jù)所述方法，將b型流感嗜血桿菌(Hib)的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲該培養(yǎng)上清液，處理該培養(yǎng)上清液以便從其提取莢膜多糖，所述培養(yǎng)基包含至少：–一種碳源，–原卟啉，–鹽，–氨基酸，–NAD或NADH，–維生素，–pH調(diào)節(jié)手段，其特征在于所述培養(yǎng)基是在化學(xué)上確定的。
【IPC分類】A61K39-102, C12N1-20, A61K47-26
【公開號】CN104583390
【申請?zhí)枴緾N201380035582
【發(fā)明人】勒希爾 J., 盧比埃 P., 巴比拉托 F., 林德利 N.
【申請人】賽諾菲巴斯德有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年7月2日
【公告號】CA2878053A1, EP2885397A1, US20150167036, WO2014006318A1