一種林蛙抗菌肽衍生物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種具有任意伸展結(jié)構(gòu)的 抗菌肽衍生物以及該肽在制備抗菌藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)的抗生物藥物在與細(xì)胞相互作用時(shí)都有特定的作用靶點(diǎn),進(jìn)而通過(guò)破壞細(xì)菌 體內(nèi)的某些特定的生理過(guò)程來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。隨著抗生素的大規(guī)模使用和濫用,細(xì)菌對(duì) 傳統(tǒng)抗生物的耐藥性已經(jīng)成為一個(gè)威脅人類健康的重大問(wèn)題,因此研宄開(kāi)發(fā)具有新穎結(jié)構(gòu) 且不易產(chǎn)生耐藥性的新型抗生素藥物已經(jīng)顯得非常的迫切??咕难苌锸巧矬w天然 防御系統(tǒng)的重要組成部分,廣泛存在于大多數(shù)的動(dòng)物、植物和微生物中,由于其具有熱穩(wěn)定 性、廣譜抗菌等特點(diǎn)已經(jīng)逐漸被科學(xué)家們廣泛關(guān)注。
[0003] 抗菌肽衍生物具有獨(dú)特的選擇性生物膜作用機(jī)制,顯示出對(duì)宿主細(xì)胞毒副作用 小、特異性強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)??咕难苌锟梢酝ㄟ^(guò)多種方式作用于細(xì)菌細(xì)胞 膜,目前普遍認(rèn)為首先抗菌肽衍生物通過(guò)靜電引力作用與細(xì)胞膜上陰離子磷脂結(jié)合,并通 過(guò)特有的alpha-螺旋結(jié)構(gòu)插入膜磷脂雙分子層形成短暫的膜孔洞的殺菌機(jī)制,使細(xì)菌很 難在短期內(nèi)通過(guò)基因突變改變整個(gè)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來(lái)產(chǎn)生耐藥性,并且其作用不受傳統(tǒng)多藥耐 藥機(jī)制的影響。因此,抗菌肽衍生物在殺滅細(xì)菌的速度上要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的抗生素,且抗菌 肽衍生物對(duì)細(xì)菌的作用都是致死性的。
[0004] 天然來(lái)源的抗菌肽衍生物一般有10-100個(gè)氨基酸殘基組成,雖然獲取途徑較多, 但是存在產(chǎn)率低,部分存在免疫原性、抗菌活性低、對(duì)宿主細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,或會(huì)引起溶 血等方面限制了抗菌肽衍生物作為抗菌藥物的推廣應(yīng)用。因此,尋找分子量更小,抗菌活性 更強(qiáng),尤其是具有抗溶血或不具有細(xì)胞毒作用的抗菌肽衍生物作為未來(lái)推廣抗菌藥物的最 關(guān)鍵的因素。近些年來(lái),科學(xué)家對(duì)抗菌肽衍生物的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系進(jìn)行了大量的研 宄,對(duì)天然抗菌肽衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和重新設(shè)計(jì),比如更換某些氨基酸殘基或根據(jù)需要 直接設(shè)計(jì)抗菌肽衍生物氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列,以期獲得活性更高、更有針對(duì)性同時(shí)對(duì)宿 主細(xì)胞無(wú)毒的抗菌肽衍生物。
[0005] 當(dāng)然,天然來(lái)源的抗菌肽衍生物部分會(huì)因?yàn)榉肿恿枯^大存在免疫原性,抗菌抗癌 活性不高,對(duì)宿主細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,或會(huì)引起溶血等方面限制了其作為抗菌抗癌藥物的 推廣應(yīng)用,因此,科學(xué)家們?cè)趯ふ倚滦涂咕难苌锏耐瑫r(shí)也開(kāi)始致力于對(duì)原有的天然抗 菌肽衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或重新設(shè)計(jì),比方說(shuō)更換某些氨基酸殘基或根據(jù)需要直接設(shè)計(jì)抗 菌肽衍生物氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),以期獲得活性更高、更有針對(duì)性同時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒害作 用的抗菌肽衍生物。
[0006] 在諸多的抗菌肽衍生物中,兩棲類抗菌肽衍生物的研宄正逐漸受到關(guān)注。由于兩 棲類動(dòng)物生活在溫暖濕潤(rùn)、微生物復(fù)雜的環(huán)境中,其皮膚經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化,也逐漸形成了抵抗 外來(lái)微生物侵襲的防御機(jī)制。兩棲類生物的皮膚分泌物中包含了大量種類繁多、功能復(fù)雜 的生物活性肽。很多兩棲類皮膚活性肽能在不損害正常細(xì)胞的前提下對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生抑殺作 用。此外,細(xì)菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種林蛙抗菌肽衍生物衍生物,一種具有任意伸展結(jié)構(gòu)的 抗菌肽衍生物,為在制備抗菌抗感染藥物方面提供可能。
[0008] 本發(fā)明的抗菌肽衍生物衍生物為人工設(shè)計(jì)合成的活性多肽,包含18個(gè)氨基酸殘 基,分子量為2542. 9Da,等電點(diǎn)為12. 6,其氨基酸序列為: SerLysValTrpArgHisTrpArgArgPheTrpHisArgAlaHisArgLysLeu本發(fā)明中的抗菌肽衍生物為人工合成,分子量小、制備方法簡(jiǎn)單方便。
[0009] 本發(fā)明所述的抗菌肽衍生物是一種具有任意伸展結(jié)構(gòu)的新型抗菌肽衍生物,在模 擬細(xì)胞膜環(huán)境下alpha-螺旋和beta-折疊的含量均比較低;利用圓二色譜(CD)和原位紅 外光譜測(cè)定抗菌肽衍生物在脂多糖作用下的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明抗菌肽衍生物在脂多糖的 作用下可以誘導(dǎo)出部分alpha-螺旋結(jié)構(gòu),并且alpha-螺旋結(jié)構(gòu)的含量隨著作用時(shí)間的增 加而提高。這些光譜數(shù)據(jù)對(duì)研宄此類抗菌肽衍生物的抑菌機(jī)制具有重要意義。
[0010] 本發(fā)明中所涉及到的抗菌肽衍生物制備簡(jiǎn)單,具有廣譜抗菌活性,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性 菌和革蘭氏陰性菌都有非常顯著的抑制作用。與最小抑菌濃度相比,此抗菌肽衍生物的溶 血性非常低。這些結(jié)果表明此抗菌肽衍生物在抗菌藥物開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面有重要價(jià)值。
[0011] 本發(fā)明中所述的抗菌肽衍生物對(duì)部分多藥耐藥細(xì)菌也顯示出良好的抗菌活性。
[0012] 本發(fā)明中所述的抗菌肽衍生物能夠滲透進(jìn)入昆明鼠的皮膚,在昆明鼠皮膚傷口 感染實(shí)驗(yàn)中能夠促進(jìn)皮膚傷口愈合,其效果明顯。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1抗菌肽衍生物在LPS作用下的圓二色譜及原位紅外譜圖; 圖2抗菌肽衍生物對(duì)皮膚傷口感染的愈合作用。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下實(shí)施例子進(jìn)一步解釋本發(fā)明的內(nèi)容,但并不用以限制本發(fā)明; 本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施,給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程,但 本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于下述的實(shí)施例; 下述實(shí)例中所用的材料、試劑等,如無(wú)特殊說(shuō)明,均可從商業(yè)途徑得到; 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。
[0015] 實(shí)施例1 抗菌肽衍生物的制備 1、抗菌肽衍生物的化學(xué)合成方法:根據(jù)
【發(fā)明內(nèi)容】
中所述的氨基酸序列,用自動(dòng)多肽合 成儀按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相肽合成程序進(jìn)行合成。合成肽經(jīng)反向HPLC(Vydac218TP1022柱) 純化;2、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F); 3、 純化的抗菌肽衍生物用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度,測(cè)試中所用純度均為 95%。用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu); 4、 抗菌肽衍生物一共包含18個(gè)氨基酸殘基,分子量為2542. 9Da,等電點(diǎn)為12. 6.其氨 基酸全序列如下: Ser-Lys-Val-Trp-Arg-Hi s-Trp-Arg-Arg-Phe-Trp-Hi s-Arg-Ala-Hi s-Arg-Lys-Leu〇
[0016] 實(shí)施例2 抗菌肽衍生物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抗菌實(shí)驗(yàn): 下述實(shí)施例中的病原菌均來(lái)自于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)及中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC),其中:金黃色葡萄球菌(AS1.72)、 蠟狀芽孢桿菌(AS1.126)、乳鏈球菌(AS1.1690)、糞腸球菌(CGMCC1.595)、屎腸球菌 (CGMCC1.2334)、表皮葡萄球菌(CICC23664)。
[0017] 最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC):為檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng) 的最低樣品濃度。采用二倍稀釋法。具體方法如下: 細(xì)菌接種于LB固體培養(yǎng)基上,37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后,用接種環(huán)挑取 單克隆菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在紫外分光光度 計(jì)上檢測(cè)菌落〇D6(KI,根據(jù)10D6(i(i= 1X10 9CFU/mL將菌落用液體LB培養(yǎng)基稀釋至2X105CFU/ mL。在無(wú)菌96孔板各孔中預(yù)先加入50yLLB液體培養(yǎng)基,然后第一孔中加入50yL稀釋 到200yM的抗菌肽衍生物樣品,混勻后取出50yL加入到第二孔,依次倍比稀釋,肽的最低 濃度是1. 56yM,至此二倍濃度梯度樣品即制備好。
[0018] 向各孔中加入已稀釋好的菌液50yL,混勻后與37°C緩慢震蕩培養(yǎng)18小時(shí),測(cè)定 600nm處的光吸收值。結(jié)果計(jì)算:取檢測(cè)不到細(xì)菌生長(zhǎng)的孔和與之相鄰的有細(xì)菌生長(zhǎng)孔樣 品濃度之和的平均值作為樣品最小抑菌濃度。結(jié)果如表1所示。
[0019] 表1抗菌肽衍生物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的最低抑菌濃度
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種林蛙抗菌肽衍生物,其特征在于:抗菌肽衍生物全序列見(jiàn)序列表SEQ ID No. 1。
2. 如權(quán)利要求1所述的林蛙抗菌肽衍生物序列,其特征在于:由18個(gè)氨基酸組成,分 子量為2542. 9Da,等電點(diǎn)為12. 6。
3. 權(quán)利要求1所述的林蛙抗菌肽衍生物在制備抑制革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌藥 物中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的林蛙抗菌肽衍生物在制備抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌藥 物中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的林蛙抗菌肽衍生物在制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的林蛙抗菌肽衍生物在制備抑制多藥耐藥菌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種林蛙抗菌肽衍生物及其應(yīng)用,屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明多肽是以中國(guó)林蛙皮膚分泌物中的天然抗菌肽為模板人工設(shè)計(jì)并化學(xué)合成的一種小分子多肽,包含18個(gè)氨基酸殘基,序列見(jiàn)序列表,分子量為2542.9Da,等電點(diǎn)為12.6。試驗(yàn)證明該小分子多肽在體外對(duì)多種細(xì)菌,具有廣譜的抑殺作用,不易產(chǎn)生耐藥性,在抑菌抑癌濃度范圍內(nèi)不具備溶血活性;此外,動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明該肽還具有抗傷口感染作用;加之其分子量小,人工合成方便,是一個(gè)極具應(yīng)用價(jià)值的小分子多肽,可用于制備新型抗菌抗感染藥物等。
【IPC分類】C07K7-08, A61K38-10, A61P17-02, A61P31-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104592359
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510000510
【發(fā)明人】尚德靜, 孫玥, 董維兵
【申請(qǐng)人】遼寧師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月4日