一種雙特異性抗體EpCAM×CD3的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，涉及雙特異性抗體的構(gòu)建和制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙特異性抗體（bispecificantibody，BiAb)是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的 人工抗體，能在靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導(dǎo)向性的效應(yīng)功能。BiAb 在生物醫(yī)學(xué)中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過BiAb介導(dǎo)細(xì)胞毒作 用殺死腫瘤細(xì)胞是當(dāng)前免疫治療應(yīng)用研宄的熱點(diǎn)，其主要特點(diǎn)是BiAb能同時(shí)結(jié)合腫瘤相 關(guān)抗原和免疫效應(yīng)細(xì)胞上的靶分子，直接觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。然 而，在雙特異性抗體藥物研發(fā)過程中，普遍存在著表達(dá)困難、產(chǎn)量低、純化難、穩(wěn)定性差等諸 多障礙，因此，構(gòu)建新的雙特異性抗體，使其能克服上述障礙，并建立相應(yīng)的免疫殺傷動(dòng)物 模型，是非常有必要的。本發(fā)明提供了一種新型雙特性抗體的構(gòu)建，并描述了對(duì)其藥效學(xué)的 研宄方法及結(jié)果。以下是針對(duì)所研宄的免疫細(xì)胞抗原和腫瘤細(xì)胞抗原，以及相關(guān)技術(shù)發(fā)展 的一些【背景技術(shù)】介紹。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4個(gè)亞基組成：S、e、丫、G，其分子質(zhì)量分別為18. 9kDa、23.lkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其長(zhǎng)度分別有171、207、182、164個(gè)氨基酸殘基。它們一起組成6條肽鏈， 常與T細(xì)胞受體（Tcellrec印tor，TCR)緊密結(jié)合形成含有8條肽鏈的TCR-CD3復(fù)合體，結(jié) 構(gòu)示意圖見圖1。此復(fù)合體具有T細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)的功能。CD3胞質(zhì)段含 免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)， TCR識(shí)別并結(jié)合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，導(dǎo)致 CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷酸化，然后 可募集其他含有SH2(Scrhomology2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磷 酸化和與ZAP-70的結(jié)合是T細(xì)胞活化信號(hào)傳導(dǎo)過程早期階段的重要生化反應(yīng)之一。因此， CD3分子的功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR識(shí)別抗原所產(chǎn)生的活化信號(hào)。
[0005] 2. EpCAM
[0006]上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM(epithelial cell adhesion molecule，CD326)，是一種 由GA-733-2基因編碼的分子量為40kDa的I型跨膜糖蛋白，作為嗜同種的鈣非依賴性的上 皮細(xì)胞間粘附分子在上皮癌變過程中發(fā)揮著作用。EpCAM是最早應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)鑒定 出的腫瘤相關(guān)抗原之一，它以多聚體的形式廣泛表達(dá)于上皮組織表面，介導(dǎo)鈣非依賴性細(xì) 胞間同型黏附功能，據(jù)此可歸入粘附分子家族。EpCAM還具備粘附分子家族的其他特性，參 與包括細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用、迀移、細(xì)胞分化、形態(tài)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝等多 種過程。同時(shí)，EpCAM在多種上皮來源的腫瘤中呈過表達(dá)，提示其與腫瘤密切相關(guān)。病理情 況下，EpCAM不同程度的表達(dá)于腺癌中，包括結(jié)直腸癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前 列腺癌、胰腺癌以及肝細(xì)胞癌和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。多項(xiàng)研宄已證實(shí)EpCAM的表達(dá)與乳腺癌 和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、周期分布、轉(zhuǎn)移有關(guān)（見表1)。單特異性抗EpCAM單克隆抗體（MAB)， 例如單抗17_lA(glaxowellcome，Centocor)，是第一個(gè)批準(zhǔn)德國(guó)EpCAM導(dǎo)向治療結(jié)直腸癌 的輔助治療，然而，大量的臨床用藥數(shù)據(jù)顯示，這種單特異性抗體相比化療沒有明顯的更加 有益的效果。目前，一些其他的EpCAM定向治療，包括雙特異性抗體，正在發(fā)展為癌癥治療 的方向，雙特異性抗體MT110和Catumaxomab都是針對(duì)腫瘤抗原EpCAM的治療性雙抗體藥 物，其中Catumaxomab已于2009年由歐盟批準(zhǔn)用于治療惡性癌性腹水，MT110已在臨床研 宄中。顯然，EpCAM已成為目前腫瘤治療研宄的熱點(diǎn)靶標(biāo)之一。
[0007] 表lEpCAM廣泛的腫瘤分布
[0008]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 雙特異性抗體，其特征在于，所述抗體包含：(a)單價(jià)單元，為輕鏈-重鏈對(duì)，該輕 鏈-重鏈對(duì)針對(duì)免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、NKT細(xì)胞或CIK細(xì)胞；優(yōu)選地，該輕鏈-重鏈對(duì)對(duì)免 疫細(xì)胞表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力；和（b)單鏈單元，為融合肽，該融合肽包含單鏈 可變片段ScFv和具有鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段，其中該融合肽針對(duì)腫 瘤細(xì)胞表面抗原具有特異性結(jié)合能力，優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是EpCAM、CD20、CD30和 ⑶133,更優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是EpCAM。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的所述雙特異性抗體，其特征在于：?jiǎn)捂渾卧腃H2結(jié)構(gòu)域位于 ScFv片段和CH3結(jié)構(gòu)域之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單鏈可變片段由輕鏈可變 區(qū)和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域組成，它們都靶向于抗原表位EpCAM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的所述雙特異性抗體，其特征在于：在所述單價(jià)單元中，輕鏈通過二 硫鍵與重鏈結(jié)合；所述重鏈通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵與所述融合肽結(jié)合。
5. 權(quán)利要求1的所述雙特異性抗體，其特征在于：?jiǎn)捂渾卧ㄡ槍?duì)EpCAM的抗體 抗-EpCAM，單價(jià)單元包括針對(duì)CD3的抗體抗-CD3 ; 優(yōu)選地，所述抗-CD3重鏈的氨基酸序列為序列號(hào)1所示的氨基酸序列，抗-CD3的輕鏈 氨基酸序列為序列號(hào)3所示的氨基酸序列，以及所述抗-EpCAM ScFv-Fc的氨基酸序列為序 列號(hào)5所示的氨基酸序列；并且抗-CD3重鏈在222位點(diǎn)上的半胱氨酸與抗-CD3的輕鏈213 位點(diǎn)上的半胱氨酸以二硫鍵的形式連接，所述的抗-CD3重鏈在228和231位點(diǎn)上的半胱氨 酸與抗-EpCAM ScFv-Fc的263和266位點(diǎn)上的半胱氨酸分別以二硫鍵的形式連接，所述的 抗-⑶3重鏈在394和411位點(diǎn)上與抗一EpCAM ScFv-Fc的436和405位點(diǎn)上形成鹽橋連 接，所述的抗-⑶3重鏈在368位點(diǎn)上與抗-EpCAM ScFv-Fc的441位點(diǎn)上形成隆突-入-穴 連接。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單價(jià)單元中的重鏈包含人 或者人源化的Fc片段，優(yōu)選地，該重鏈的Fc片段包含人IgG Fc片段；所述融合肽的Fc片 段包含人或者人源化的Fc片段，優(yōu)選地，該融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單價(jià)單元的人IgG Fc段和 所述單鏈單元的IgG Fc通過鹽橋和隆突-入-穴結(jié)構(gòu)連接。
8. 制備權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述雙特異性抗體的方法，其特征在于，所述方法包括 步驟： (1) 分別將單價(jià)單元的重、輕鏈分別構(gòu)建到第一表達(dá)載體上，將單鏈單元構(gòu)建到第二表 達(dá)載體上； (2) 將第一和第二表達(dá)載體一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，培養(yǎng)并取上清； (3) 將表達(dá)上清分離得到純化后的雙特異性抗體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞是CHO-S細(xì)胞；或 者優(yōu)選地，所述分離步驟包括：蛋白A親和層析柱從表達(dá)上清中捕獲所有帶Fc結(jié)構(gòu)域的抗 體，通過SP陽離子交換層析實(shí)現(xiàn)目標(biāo)雙特異性抗體與副產(chǎn)物的分離，再過Q柱，最后濃縮置 換緩沖液PBS。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的所述方法，所述第一表達(dá)載體是pCHOl. 0 ;所述第二表達(dá)載體是 pCHOl. 0-潮霉素。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8的所述方法，其特征在于，所述方法的步驟（1)中： 所述單價(jià)單元為抗-CD3抗體，擴(kuò)增其輕鏈所用引物為Kozak(EcoR V)F、 MK-Leader (EcoRV)F、L2K-VL(MK)Fl 和 hlgK(PacI)R，通過重疊 PCR 擴(kuò)增，將 Kozak 序列、 前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)EcoR V與PacI引入輕鏈；擴(kuò)增其重鏈所用引物為Kozak(Avr II)F、 MK-Leader (AvrII)F、L2K-VH(MK)Fl 和 hlgGl (sbfl) R，通過重疊 PCR 擴(kuò)增，將 Kozak 序列、 前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)AvrII與BstZ17I引入重鏈；將擴(kuò)增好的LC基因片段與用EcoR V與 PacI酶切過的pCHOl. 0表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗-⑶3輕鏈的表達(dá)載體；然后用 AvrII與BstZ17I酶切后再和HC進(jìn)行同源重組，獲得抗-⑶3的pCHOl. O表達(dá)載體，質(zhì)粒命 名為 pCHOl. O-抗-CD3-HL-LDY ; 所述單鏈單元為抗-EpCAM ScFv-Fc抗體，擴(kuò)增其所用引物為Kozak(Avr II)F、 MK-Leader (AvrII)F、M701-VH Fl 和hlgGl (sbfl) R，通過PCR擴(kuò)增抗EpCAM ScFv-Fc 結(jié)構(gòu)域， 將Kozak序列、前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)AvrII與BstZ17I引入ScFv-Fc，將擴(kuò)增好的基因片段 與酶切過的pCHOl. O-潮霉素表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗EpCAM ScFv-Fc的表達(dá)載 體，質(zhì)粒命名為pCHOl. 0-潮霉素-抗-EpCAM-ScFv-Fc-KKW。
11. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述雙特異性抗體或者按照權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)制備的 雙特異性抗體的方法制備的雙特異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療EpCAM 特異抗原表達(dá)所引起的腫瘤或相關(guān)疾病，或者用于殺死表達(dá)EpCAM細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述雙特異性抗體或者按照權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)制備的 雙特異性抗體的方法制備的雙特異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于在腫瘤細(xì)胞 系中篩選用于治療表達(dá)EpCAM特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物或者評(píng)價(jià)用于治療表 達(dá)EpCAM特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物的藥效。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體，本申請(qǐng)的雙特異性抗體由單鏈單元和單價(jià)單元組成，其中該單價(jià)單元針對(duì)免疫細(xì)胞的表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力，該單鏈單元針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原EpCAM具有特異性結(jié)合能力；該單鏈單元包含與Fc片段融合的單鏈可變片段(ScFv)，該單價(jià)單元包含輕鏈和重鏈對(duì)。本申請(qǐng)還提供雙特異性抗體的制備方法，這些抗體的藥學(xué)用途。
【IPC分類】C12N15-85, C07K16-46, C07K16-30, A61P35-00, A61K39-395
【公開號(hào)】CN104592391
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510029971
【發(fā)明人】王濤, 胡柳, 馬瑩瑩, 劉敬松, 陳婷, 范克索, 周鵬飛
【申請(qǐng)人】武漢友芝友生物制藥有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月21日