一種雙特異性抗體cd19×cd3的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說涉及雙特異性抗體的構(gòu)建和制備方法， 以及雙抗體功能和性質(zhì)檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙特異性抗體（bispecificantibody，BiAb)是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點的 人工抗體，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導(dǎo)向性的效應(yīng)功能。BiAb在 生物醫(yī)學(xué)中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過BiAb介導(dǎo)細胞毒作用 殺死腫瘤細胞是當前免疫治療應(yīng)用研宄的熱點，其主要特點是BiAb能同時結(jié)合腫瘤相關(guān) 抗原和免疫效應(yīng)細胞上的靶分子，直接觸發(fā)免疫效應(yīng)細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。以下 是針對所研宄的免疫細胞抗原和腫瘤細胞抗原，以及相關(guān)技術(shù)發(fā)展的一些【背景技術(shù)】介紹。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4個亞基組成：S、e、丫、6，其分子質(zhì)量分別為18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其長度分別有171、207、182、164個氨基酸殘基。它們一起組成6條 肽鏈，常與T細胞受體（Tcellrec印tor，TCR)緊密結(jié)合形成含有8條肽鏈的TCR-CD3 復(fù)合體，結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。此復(fù)合體具有T細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)的功能。 ⑶3胞質(zhì)段含免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivation motif,ITAM)，TCR識別并結(jié)合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗 原肽，導(dǎo)致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷 酸化，然后可募集其他含有SH2(Scrhomology2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。 ITAM的磷酸化和與ZAP-70的結(jié)合是T細胞活化信號傳導(dǎo)過程早期階段的重要生化反應(yīng)之 一。因此，CD3分子的功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號。
[0005] 2.CD19
[0006] ⑶19在正常及惡性B淋巴細胞中均有表達，被視為B細胞發(fā)育過程中一個涵蓋階 段較長的最為可靠的表面標記物。在正常淋巴組織中，⑶19表達于生發(fā)中心的B細胞和濾 泡樹突狀細胞、套細胞、濾泡間T細胞區(qū)的樹突狀大細胞，與CD20和CD22染色模式基本相 同，但同⑶20相比，⑶19在前B細胞中也表達。此外，通過流式細胞學(xué)檢測方法，⑶19在 人體組織分離得到的漿細胞中可以檢測到。通常來說⑶19在B淋巴細胞瘤中表達，其中包 括B淋巴細胞淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、邊 緣區(qū)淋巴。
[0007] 3.雙特異性抗體技術(shù)發(fā)展
[0008] 雙特異性抗體，一個抗體分子中的兩個抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原 表位的抗體。
[0009] 抗體藥物是以細胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的生物 大分子藥物，具有特異性高、性質(zhì)均一、可針對特定靶點定向制備等優(yōu)點。單克隆抗體在臨 床上主要應(yīng)用于以下三個方面：腫瘤治療、免疫性疾病治療以及抗感染治療。其中腫瘤的治 療是目前單抗應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域，目前已經(jīng)進入臨床試驗和上市的單抗產(chǎn)品中，用于腫 瘤治療的產(chǎn)品數(shù)量占比大概為50%。單克隆抗體治療腫瘤是一種針對病變細胞特異靶點刺 激免疫系統(tǒng)來殺傷靶細胞的免疫療法，為了增強抗體的效應(yīng)功能，特別是殺傷腫瘤細胞的 效果，人們嘗試多種方法改造抗體分子，雙特異性抗體是改善抗體治療效果的發(fā)展方向之 一，現(xiàn)已成為抗體工程研宄領(lǐng)域的熱點。
[0010]用于免疫治療的雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，能在 靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療 中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0011] 4.雙特異性抗體制備
[0012]雙特異性抗體可通過多種途徑獲得，其制備方法主要有：化學(xué)偶聯(lián)法、雜交一雜交 瘤法和基因工程抗體制備法?；瘜W(xué)偶聯(lián)法是將2個不同的單克隆抗體用化學(xué)偶聯(lián)的方式連 接在一起，制備出了雙特異性單克隆抗體，這是最早的雙特異性單克隆抗體概念。雜交一雜 交瘤法是通過細胞雜交法或者三元雜交瘤的方式產(chǎn)生雙特異性單克隆抗體，這些細胞雜交 瘤或者三元雜交瘤是通過建成的雜交瘤融合，或者建立的雜交瘤和從小鼠得到的淋巴細胞 融合而得到的，只能生產(chǎn)出鼠源的雙特異性抗體，它的應(yīng)用受到了極大的限制。而隨著分子 生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了基因工程人源化雙特異性抗體的多種構(gòu)建模式，并主要分 為雙特異性微抗體，雙鏈抗體，單鏈雙價抗體，多價雙特異性抗體四類。目前，國際上已有數(shù) 種基因工程雙特異性抗體藥物進入臨床試驗階段，并顯示有較好的應(yīng)用前景。
[0013] 5.腫瘤的過繼免疫治療
[0014]腫瘤的過繼免疫治療是將自體或異體的免疫活性細胞經(jīng)過體外擴增后輸入患者 體內(nèi)，直接殺傷腫瘤細胞，調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能，主要包括LAK細胞、TIL細胞、激活 的T淋巴細胞和CIK細胞的免疫治療。而免疫療法只能清除少量的、零散的腫瘤細胞，對于 晚期的實體腫瘤療效有限。故常將其作為一種輔助療法與手術(shù)、化療、放療等常規(guī)方法聯(lián)合 應(yīng)用。先用常規(guī)方法清掃大量的腫瘤細胞后，再用免疫療法清除殘存的腫瘤細胞，可提高腫 瘤綜合治療的效果。其中，過繼免疫治療作為腫瘤綜合治療中的一個新方法，已經(jīng)與常規(guī)手 術(shù)治療、放療、化療及其他細胞和分子治療得到廣泛配合，在多種腫瘤的治療中展示了廣泛 的應(yīng)用前景。然而，一種更理想的方式應(yīng)該是，雙特異性抗體一端可以結(jié)合培養(yǎng)好的免疫細 胞的表面抗原CD3,并隨之一起輸入體內(nèi)，而雙特異性抗體的另一端能很好地結(jié)合腫瘤細 胞的表面抗原；這樣，雙特異性抗體就能在體內(nèi)架起腫瘤細胞和免疫細胞之間的橋梁，使免 疫細胞集中在腫瘤細胞周圍，進而對腫瘤細胞進行殺傷。通過這種方法可有效解決腫瘤細 胞的轉(zhuǎn)移和擴散，克服了手術(shù)、放化療三大傳統(tǒng)治療方式后的"不徹底、易轉(zhuǎn)移、副作用大" 等弊端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 術(shù)語和縮略語
[0016] BiAb:雙特異性抗體（bispecific antibody)
[0017] TA:腫瘤抗原（tumor antigen)
[0018] VH:重鏈可變區(qū)（heavy chain variable region)。
[0019] VL:輕鏈可變區(qū)（light chain variable region)〇
[0020] CL:輕鏈恒定區(qū)（constantregionoflightchain)。
[0021] CDR :是英文Complementarity determining regions (CDRs)的縮寫，是指抗體的 抗原互補決定區(qū)。
[0022] ScFv :單鏈可變區(qū)抗體片段（single-chain variable fragment)，又稱為單鏈抗 體。
[0023]CLD:細胞系開發(fā)（celllinedevelopment)
[0024] FACS:焚光激活細胞分選（Fluorescence-activated cell sorting)，也稱為流式 細胞分選術(shù)。
[0025] 本發(fā)明針對常規(guī)單克隆抗體的不足之處，通過基因工程和抗體工程的方法進行的 新分子-雙特異性抗體的創(chuàng)制，在傳統(tǒng)單克隆抗體主要通過CDC，ADCC和凋亡能力來殺傷腫 瘤細胞的基礎(chǔ)上，增加了介導(dǎo)T細胞的免疫療法，大大提高了免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞的功 效。
[0026] 具體地，本發(fā)明提供了以下的技術(shù)方案：
[0027] 在一種實施方式中，提供一種雙特異性抗體，其特征在于，所述該抗體包含：(a) 單價單元，為輕鏈-重鏈對，該輕鏈-重鏈對針對腫瘤細胞表面抗原具有特異性結(jié)合能力， 優(yōu)選地該腫瘤細胞表面抗原是CD19、CD20、CD30和CD133,更優(yōu)選地該腫瘤細胞表面抗原是 CD19;和（b)單鏈單元，為融合肽，該融合肽包含單鏈可變片段ScFv和具有鉸鏈區(qū)、CH2結(jié) 構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段，其中該融合肽針對的免疫細胞選自T細胞、NKT細胞或CIK細 胞；優(yōu)選地，該融合肽對免疫細胞表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力。
[0028] 在一種實施方式中，所述雙特異性抗體的單鏈單元的CH2結(jié)構(gòu)域位于ScFv片段和 CH3結(jié)構(gòu)域之間。
[0029] 在一種實施方式中，雙特異性抗體的單鏈可變片段由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)結(jié) 構(gòu)域組成，它們都靶向于抗原表位CD3。
[0030] 在一種實施方式中，在單價單元中，輕鏈通過二硫鍵與重鏈結(jié)合；重鏈通過一個或 多個二硫鍵與所述融合肽結(jié)合。
[0031] 在一種實施方式中，單價單元包括針對人源⑶19的抗體抗-⑶19;
[0032] 在一種實施方式中，抗體抗-CD19的重鏈的氨基酸序列為序列號1所示的氨基 酸序列，抗體抗-CD19的輕鏈的氨基酸序列為序列號3所示的氨基酸序列，以及所述的 抗-⑶3ScFv-Fc的氨基酸序列為序列號5所示的氨基酸序列；并且抗-⑶19重鏈在227位 點上的半胱氨酸與抗-CD19的輕鏈218位點上的半胱氨酸以二硫鍵的形式連接，所述的 抗-⑶19重鏈在233和236位點上的半胱氨酸與抗-⑶3ScFv-Fc的255和258位點上的半胱 氨酸分別以二硫鍵的形式連接，所述的抗-⑶19重鏈在399和416位點上與抗-⑶3ScFv-Fc 的428和397位點上形