一種多肽修飾的聚陽離子基因載體及制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽修飾的聚陽離子基因載體及制備方法及應用，屬于具有生物靶向識別功能的基因載體技術領域。
【背景技術】
[0002]在發(fā)達國家及中等發(fā)達國家，心腦血管疾病已經(jīng)成為威脅人類生命安全的最主要疾病之一。目前對于心腦血管疾病的介入治療主要是基于小口徑人工血管的構建。但是小口徑人工血管術后往往引起再狹窄和血栓，會對患者的生命安全造成二次威脅。研宄表明，對人工血管材料表面實現(xiàn)快速全面的內(nèi)皮化是解決再狹窄及血栓的有效方法?；蛑委熀投嚯陌邢蛑委熆梢杂行崿F(xiàn)快速全面內(nèi)皮化。
[0003]基因治療就是將目的基因?qū)塍w內(nèi)，通過目的基因的表達達到治愈的效果。有效的基因載體是基因治療得以成功的關鍵。常用的基因載體有兩類，一類是病毒類的，一類是非病毒類的。由于病毒類載體存在安全系數(shù)低、制備難度大和對目的基因要求程度高等問題，在實際應用中不如非病毒類載體應用廣泛。非病毒載體有多種，但效果最好的是聚乙烯亞胺類。考慮到高數(shù)均分子量聚乙烯亞胺的毒性，因此在實際研宄中低數(shù)均分子量的聚乙烯亞胺是廣受歡迎的。我們課題組一直致力于研宄可生物降解的聚陽離子型基因載體?？赏ㄟ^自組裝的技術，有效提高載體表面的正電荷密度，高效負載基因，同時可生物降解的聚合物核又不會帶來高的生物毒性。
[0004]血管內(nèi)皮細胞表面具有區(qū)別于其他種類細胞的膜蛋白受體，可以特異性的識別一些多肽分子。REDV (精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸)多肽就能夠與內(nèi)皮細胞膜表面的α4β I整合素發(fā)生特異性的識別作用，從而提高REDV多肽在內(nèi)皮細胞表面的粘附。如果將REDV多肽接枝到基因載體表面，通過REDV多肽與內(nèi)皮細胞的特異性結合作用，可以提高基因復合物在內(nèi)皮細胞表面的富集，從而增加基因復合物被內(nèi)吞的概率，基因轉(zhuǎn)染效率就會隨之增加。目前對于這種REDV多肽靶向的基因載體在促進內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染方面的研宄還較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是在提供一種生物靶向識別性能好，轉(zhuǎn)染效率高，生物毒性低的多肽修飾的聚陽離子基因載體。
[0006]本發(fā)明的第二個目的是提供一種多肽修飾的聚陽離子基因載體的制備方法。
[0007]本發(fā)明的第三個目的是提供一種多肽修飾的聚陽離子基因載體的應用。
[0008]本發(fā)明的技術方案概述如下:
[0009]一種多肽修飾的聚陽離子基因載體的制備方法，包括如下步驟:
[0010](I)琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-CO-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)的制備:
[0011]在氮氣氛保護下，將數(shù)均分子量為5800-10500的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-CO-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(I)，琥珀酸酐以及催化劑4-二甲氨基吡啶，縛酸劑三乙胺加入到溶劑無水二氧六環(huán)中使溶解，在室溫攪拌下反應20-30h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗產(chǎn)物，真空干燥，干燥物用N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜溶解，用截留分子量為5000-10000的透析管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍干燥，得到白色的琥珀?；膯渭酌逊舛说木垡叶?聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)，所述單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4- 二甲氨基吡啶和三乙胺的摩爾比為1:(5-10): (5-10): (3-6)，所述單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物中親水段單甲醚封端的聚乙二醇數(shù)均分子量為2000-3500，疏水段聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)的數(shù)均分子量為3800-7000 ；
[0012](2)單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)_聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)的制備:
[0013]在氮氣氛保護下，以摩爾比為I: (5-10): (5-10):(4_6)，將式(II)所示共聚物、(1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、數(shù)均分子量為1800-3500的支鏈的聚乙烯亞胺加入到N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中使溶解，在室溫攪拌下反應18-28h，用截留分子量為5000-10000的透析管在蒸餾水中透析48_60h，冷凍干燥，得到白色的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)_聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III);
[0014](3)由式(III)共聚物合成多肽修飾的聚陽離子基因載體(IV):
[0015]在氮氣氛保護下，按比例將I質(zhì)量份的式(III)所示共聚物、0.1-0.2質(zhì)量份的數(shù)均分子量為2000的兩端分別為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇，加入到混合溶劑中使溶解，在避光條件下，于室溫下反應2-4h，加入簡寫為CREDVW的多肽，室溫下反應4-6h，產(chǎn)物用截留分子量為5000-12000的透析管在蒸餾水中透析48_60h，冷凍干燥，得到白色的多肽修飾的聚陽離子基因載體(IV)，所述混合溶劑為2體積份的pH = 8.4的
0.lmol/L磷酸緩沖溶液和3體積份的二甲基亞砜混合而成；所述兩端分別為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇與CREDVW多肽的摩爾比為1: (0.7-1)。
[0016]上述方法制備的一種多肽修飾的聚陽離子基因載體。
[0017]上述多肽修飾的聚陽離子基因載體在提高內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染效率方面的應用。
[0018]本發(fā)明的一種多肽修飾的聚陽離子基因載體集靶向識別與基因治療于一身。通過CREDVff多肽中的REDV多肽與內(nèi)皮細胞表面的整合素的特異性識別作用，可以提高基因載體復合物在內(nèi)皮細胞表面的富集，從而增強基因復合物被內(nèi)皮細胞內(nèi)吞的概率，目的基因在內(nèi)皮細胞中的轉(zhuǎn)染效率就會隨之增加。
【附圖說明】
[0019]圖1A為單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物⑴的1HNMR圖。
[0020]圖1B為琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物
(II)的 1HNMR 圖。
[0021]圖1C為單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)酯)_聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)的 1H NMR 圖。
[0022]圖2為熒光性能比較圖:(I) 0.50mg/mL的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-Co-己內(nèi)醋)-聚乙稀亞胺嵌段共聚物(III)的發(fā)射光譜圖，(2)0.78mg/mL多肽修飾的聚陽離子基因載體(IV)的發(fā)射光譜圖，(3)0.15mg/mL的CREDVW多肽的發(fā)射光譜圖。(mPEG-P(LA-co-CL)-PEI指代單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸_co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物，mPEG-P (LA-co-CL) -PE1-REDV指代多肽修飾的聚陽離子基因載體)。
[0023]圖3為多肽修飾的聚陽離子基因載體的透射電鏡圖。
[0024]圖4為多肽修飾的聚陽離子基因載體的動態(tài)光散射粒徑分布圖。
[0025]圖5為多肽修飾的聚陽離子基因載體與PZNF580基因形成的復合物在不同氮磷比(N/P)結合時的流體學粒徑和Zeta電位分布圖。
[0026]圖6為多肽修飾的聚陽離子基因載體與PZNF580基因形成的復合物在不同N/P結合時的凝膠成像電泳圖。
[0027]圖7為PEI1800/pZNF580基因復合物(N/P = 10)，多肽修飾的聚陽離子基因載體與PZNF580基因形成的復合物(N/P = 10)對EA.hy926內(nèi)皮細胞的存活率考察效果圖。
[0028]圖8 (A)為單獨pZNF580基因在EA.hy926內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結果(空白對照)；
[0029]圖8 (B)為PEI1800/pZNF580基因復合物在EA.hy926內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結果(陰性對照)；
[0030]圖8 (C)為PEI25000/pZNF580基因復合物在EA.hy926內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結果(陽性對照)；
[0031]圖8 (D)為多肽修飾的聚陽離子基因載體/pZNF580基因復合物在EA.hy926內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染結果。(PEI1800和PEI25000分別是指數(shù)均分子量為1800和25000的聚乙烯亞胺)
[0032]本發(fā)明各個共聚物的聚(乳酸-CO-己內(nèi)酯)部分的數(shù)均分子量由核磁積分面積計算得到。
【具體實施方式】
[0033]半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-色氨酸的多肽簡稱為CREDVW，委托上海吉爾生化有限公司制備。
[0034]數(shù)均分子量為2000的兩端分別為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇簡稱為0PSS-PEG-NHS，購于北京鍵凱科技有限公司。
[0035]數(shù)均分子量為2000-3500的單甲醚封端的聚乙二醇，購于天津希恩思生化科技有限公司。
[0036]聚