一種小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液及培養(yǎng)小型角毛藻的培養(yǎng)方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液制備方法和高效培養(yǎng)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]小型角毛藻Chaetoceros minutissismus是一種小型海洋浮游娃藻，隸屬娃藻門，中心綱，盒形藻目，角毛藻科，角毛藻屬。細(xì)胞小，壁薄，大多單個細(xì)胞，也有2-3個細(xì)胞連成群體。殼面橢圓形至圓形，中央略凸起，少數(shù)平坦。殼環(huán)面成長方形至四角形，細(xì)胞長4.6_9.2微米，寬3.45_4.6微米，冗環(huán)市不明顯。角毛細(xì)而長，末?而尖，自細(xì)胞四角生出，幾乎與縱軸平行，長20.7-34.5微米。兩端的角毛以細(xì)胞體為中心略呈“S”形。色素體一個，片狀，黃褐色。培養(yǎng)過程中細(xì)胞常變形。變形的細(xì)胞拉長，角毛縮短或一個殼面的角毛完全消失。變形后藻體比正常的大。正常情況下，小型角毛藻培養(yǎng)液呈金黃色，無沉淀，培養(yǎng)密度可達(dá)33萬個/ml，適宜鹽度范圍26-35%。，適溫5_30°C，生長率隨水溫升高而提高，超過30°C下降，最適溫度30°C，最適光照10000-150001ux。適宜P H6.4-9.5，最適8.0-8.9。二分裂繁殖，環(huán)境不良時可形成休眠孢子，也能形成復(fù)大孢子。屬廣溫、廣鹽藻類，水溫20-30°C、鹽度30%。時生長最快。與其它單胞藻如球等鞭金藻、湛江叉鞭金藻、扁藻、三角褐指藻相比，該藻繁殖快，易培養(yǎng)，耐高溫，營養(yǎng)價值高，是對蝦、海參、文蛤、牡蠣、鮑魚、魁蚶、海膽等海珍品優(yōu)質(zhì)育苗餌料。
[0003]關(guān)于微藻培養(yǎng)液，傳統(tǒng)做法是現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，缺點是操作麻煩，工作量大，特別是一些微量成分和元素，用量極少，稱量麻煩，誤差大，且培養(yǎng)液不便運(yùn)輸和商品化、市場化運(yùn)作，不適應(yīng)現(xiàn)代海洋微藻大規(guī)模、集約化、工廠化生產(chǎn)的趨勢。目前，小型角毛藻規(guī)?；囵B(yǎng)存在的主要問題是藻細(xì)胞生長緩慢、倍增時間長。過去楊彥豪發(fā)明了一種牟氏角毛藻的培養(yǎng)基配方及全人工快速培養(yǎng)方法(申請?zhí)朇N201310420414)。培養(yǎng)基配方包括尿素0.1-0.3g/L，碳酸氫鈉0.05-0.lg/L，硅酸鈉水結(jié)晶0.1-0.5g/L，磷酸二氫鉀0.01-0.02g/L，EDTA 3_5g/L，VBJ-Smg/L, VB121-3 μ g/L，配方溶劑為海水；培養(yǎng)方法為對培養(yǎng)罐、海水消毒后，以海水為溶劑按照以上配方配培養(yǎng)基，將接藻種接入裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中，密封后培養(yǎng)，培養(yǎng)時進(jìn)行三基色燈光光照并充入經(jīng)過孔徑小于0.1 ym空氣濾芯過濾的空氣，培養(yǎng)3-5天后采收。該發(fā)明培養(yǎng)基配方營養(yǎng)均衡、成本低，培養(yǎng)方法使角毛藻快速生長，過程操作簡單，但是培養(yǎng)罐容積小，一次只能培養(yǎng)少量藻液，很難在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，且購置培養(yǎng)罐投資大，技術(shù)要求高，普通工人難以掌握。楊海麟發(fā)明了一種自養(yǎng)產(chǎn)油微藻的高密度培養(yǎng)工藝(申請?zhí)朇N201010509643)，采用分割法與二步法相耦合的發(fā)酵方法，以火電廠排放的CO2廢氣為碳源，以過濾除雜菌或雜藻后的市政污水作為培養(yǎng)基，高密度培養(yǎng)產(chǎn)油微藻，微藻選自小球藻、微擬球藻、布朗葡萄藻、纖細(xì)角毛藻、海綠球藻、球等鞭金藻、新月菱形藻、三角褐指藻、杜氏藻和菱形藻的一種或幾種，該發(fā)明能實現(xiàn)氮、磷及CO2高去除效率且藻濃度、油脂及蛋白含量高，達(dá)到保護(hù)環(huán)境和生產(chǎn)生物資源雙重效果，成本低，無污染，綜合效益高，但該法工藝流程長，操作麻煩，易污染，效率低下。
[0004]為了克服傳統(tǒng)技術(shù)的不足，本發(fā)明公開了一種小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液制備方法和高效培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢表現(xiàn)在:I)摒棄了傳統(tǒng)培養(yǎng)液現(xiàn)用現(xiàn)配的做法，配制小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液，使用方便，工作量小，儲存、運(yùn)輸方便，便于培養(yǎng)液的工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化、市場化、商品化、專業(yè)化生產(chǎn)，微量成分和元素定量準(zhǔn)確，誤差小，且對傳統(tǒng)使用的m營養(yǎng)鹽配方進(jìn)行了優(yōu)化，補(bǔ)充了雞糞浸出液，NaHCO3，人尿，Na2S13，過磷酸鈣，土壤浸出液，海泥抽取液，MgSO4, Ca(NO3)2, CaCl2, CH3COONa, CH3CH2COONa,吲哚乙酸等成分，成分更加科學(xué)、合理、均衡，有利于微藻快速生長且消毒徹底，干凈衛(wèi)生，不易污染；2)使用塑料純凈水桶養(yǎng)殖小型角毛藻，操作靈活，不易污染，洗刷方便，不易劃破和碰碎，成本低，產(chǎn)量高；3)尊重小型角毛藻的生長規(guī)律，根據(jù)藻類不同生長階段對環(huán)境條件的特定要求，在培養(yǎng)的早、中、晚期提供不同的光照時間、強(qiáng)度和溫度，在早期光照時間較短，強(qiáng)度較小，避免強(qiáng)光對藻細(xì)胞造成光傷害，晚期提供較強(qiáng)的光照強(qiáng)度和時間及較高的溫度，有利于細(xì)胞中EPA、DHA等高不飽和脂肪酸大量積累；且在培養(yǎng)的中后期補(bǔ)充營養(yǎng)鹽，促進(jìn)角毛藻的持續(xù)、快速生長；小型角毛藻產(chǎn)量能提高120% ;4)采用三個塑料桶串聯(lián)養(yǎng)殖，通入的氣體得到三次利用，節(jié)約了能量和資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液及培養(yǎng)小型角毛藻的培養(yǎng)方法，具體方法如下:
[0006]步驟I小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液的制備
[0007]培養(yǎng)液成分配方:雞糞浸出液I份，NaHCO30.6份，人尿0.7份，Na2S130.02份，f/2微量元素溶液0.8份，f/2維生素溶液0.8份，過磷酸鈣0.1份，土壤浸出液0.6份，海泥抽取液 0.8 份，MgS04.7H20 0.2 份，Ca(NO3)20.3 份，CaCl2.2H20 0.5 份，CH3COONa 0.05 份，CH3CH2COONa 0.1份，吲哚乙酸0.001份，煮沸冷卻海水100份；裝入三角燒瓶，放在搖床上搖勻15分鐘，濃縮培養(yǎng)液制備完成；其中f/2微量元素溶液配方(按配制1000毫升溶液計):ZnS04.4H20 23 毫克，MnCl2.4H20 178 毫克，CuSO4.5H20 10 毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5H20 3.9克，Na2MoO4.2H20 7.3 毫克，CoCl2.6H20 12 毫克，Na2EDTA 4.35 克，蒸餾水 1000 毫升；f/2維生素溶液配方(按配制1000毫升溶液計):維生素B120.5毫克，維生素B110毫克，維生素H 0.5毫克，蒸飽水1000毫升。
[0008]步驟2小型角毛藻高效培養(yǎng)方法
[0009]取三個20升的帶把的塑料純凈水桶(市場有售)，分別加入步驟I所述培養(yǎng)液1000毫升，然后加入9000毫升煮沸冷卻的普通海水，搖勻；選生長旺盛、無污染、處于指數(shù)生長期的小型角毛藻藻種接種，接種密度4萬個細(xì)胞/毫升藻液，輕輕搖勻3分鐘。每個純凈水桶瓶口插入兩根玻璃管，管的直徑為8毫米，一根為充氣管，另一根為排氣管，第2個桶的充氣管與第一個桶的排氣管相連，第3個桶的充氣管與第2個桶的排氣管相連，這樣充入的氣體依次經(jīng)過三個塑料桶，可得到3次利用。第一個桶的充氣管上端連接空氣壓縮機(jī)，另一端插入到藻液底部，充入混合氣體，氣體成分=空氣99% +純CO20.5%-j^一氧化氮0.3%+氨氣0.2%，每天24小時不間斷充氣，氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可；將這3個塑料桶放入微藻培養(yǎng)室中培養(yǎng)，室內(nèi)空調(diào)控溫，日光燈管照明，以打開燈管的數(shù)量多少來控制光照強(qiáng)度，連續(xù)培養(yǎng)9天，前3天調(diào)節(jié)溫度至25°C，光照強(qiáng)度60001uX，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供間歇光，6小時連續(xù)光照，6小時連續(xù)黑暗，如此循環(huán)；第4-6天，調(diào)節(jié)溫度至26°C，光照強(qiáng)度90001ux，每天提供15小時連續(xù)光照，然后9小時連續(xù)黑暗，如此循環(huán)，至第5天，每個瓶子補(bǔ)加步驟I所述的濃縮培養(yǎng)液50毫升，第7-9天，調(diào)節(jié)溫度至28°C，光照強(qiáng)度120001uX，每天24小時連續(xù)光照，沒有黑暗，第7天，每個桶補(bǔ)加蒸餾水250毫升，至第8天，每個桶補(bǔ)加步驟I所述的濃縮培養(yǎng)液30毫升，到第9天，小型角毛藻細(xì)胞密度可達(dá)75萬/暈升藻液，培養(yǎng)完畢。
[0010]有益結(jié)果
[0011]關(guān)于微藻培養(yǎng)液，傳統(tǒng)做法是現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，操作麻煩，工作量大，特別是一些微量成分和元素，用量極少，稱量麻煩，誤差大，且不便運(yùn)輸和商品化、市場化運(yùn)作。為了克服傳統(tǒng)技術(shù)的不足，本發(fā)明公開了一種小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液制備方法和高效培養(yǎng)技術(shù)。本技術(shù)優(yōu)勢表現(xiàn)在:1)摒棄了傳統(tǒng)培養(yǎng)液現(xiàn)用現(xiàn)配的做法，配制小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液，使用方便，工作量小，儲存、運(yùn)輸方便，便于培養(yǎng)液的工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化、市場化、商品化、專業(yè)化生產(chǎn)，微量成分和元素定量準(zhǔn)確，誤差小，且對傳統(tǒng)使用的f/2營養(yǎng)鹽配方進(jìn)行了優(yōu)化，成分更加科學(xué)、合理、均衡，有利于微藻快速生長；2)使用塑料純凈水桶養(yǎng)殖小型角毛藻，透光性好，操作靈活，不易污染，洗刷方便，不易劃破和碰碎，成本低，產(chǎn)量高；3)尊重小型角毛藻的生長規(guī)律，根據(jù)藻類不同生長階段對環(huán)境條件的特定要求，在培養(yǎng)的早、中、晚期提供適宜的光照時間、強(qiáng)度和溫度，有利于細(xì)胞中EPA、DHA等高不飽和脂肪酸大量積累；且在培養(yǎng)中后期補(bǔ)充營養(yǎng)鹽，促進(jìn)角毛藻持續(xù)、快速生長；小型角毛藻產(chǎn)量能提高120%;4)采用三個塑料桶串聯(lián)養(yǎng)殖，通入的氣體得到三次利用，節(jié)約了能量和資源。
【附圖說明】
[0012]圖1為小型角毛藻形態(tài)；
[0013]圖2為小型角毛藻高效培養(yǎng)方法，其中附圖標(biāo)記為:1充氣管，2排氣管；箭頭所指為氣體走向。
【具體實施方式】
[0014]一種小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液及培養(yǎng)小型角毛藻的培養(yǎng)方法，具體方法如下:
[0015]步驟I小型角毛藻濃縮培養(yǎng)液的制備