一種大腸埃希氏菌株hy-05c高密度培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大腸埃希氏菌株HY-05C高密度 培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 天冬氨酸又稱氨基丁二酸，是構(gòu)成機(jī)體蛋白質(zhì)的主要氨基酸之一。天冬氨酸是生 命體中合成賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的前體。L-天冬氨 酸參與鳥氨酸循環(huán)，促進(jìn)氨和二氧化碳生成尿素，降低血液中氨和二氧化碳的含量，增強(qiáng)肝 功能，可用做氨解毒劑、肝機(jī)能促進(jìn)劑、疲勞恢復(fù)劑等醫(yī)藥用品和各種清涼飲料的添加劑。 天冬氨酸與L-苯丙氨酸合成的二肽甜味劑阿斯巴甜，甜度高、熱量低，適于糖尿病、高血壓 等患者，安全可靠；以L-天冬氨酸為原料合成的新型強(qiáng)力甜味劑紐甜，不僅適用于包括兒 童、孕婦、哺乳期婦女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者內(nèi)的所有人群，還適用于不能食用 阿斯巴甜的苯酮尿癥患者。
[0003] 目前L-天冬氨酸主要是由產(chǎn)L-天冬氨酸的游離整體細(xì)胞一步轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)。 生產(chǎn)過程大體如下：首先培養(yǎng)產(chǎn)L-天冬氨酸酶的菌體細(xì)胞，然后再將菌體培養(yǎng)液加入到含 有富馬酸銨的轉(zhuǎn)化體系中，富馬酸銨在L-天冬氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化生成L-天冬氨酸銨，轉(zhuǎn) 化完成后再通過酸解、等電點(diǎn)結(jié)晶等得工序得到成品L-天冬氨酸。提高單位體積菌體培養(yǎng) 液的酶活力是提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。提高單位體積培養(yǎng)液中的酶活性主要有兩種方法，一 是通過菌種誘變提高菌體的產(chǎn)酶能力。另外，就是通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高單位 體積培養(yǎng)液中產(chǎn)酶菌體細(xì)胞個(gè)數(shù)，即增加培養(yǎng)液中菌體細(xì)胞濃度。
[0004] 申請(qǐng)人擁有游離整體細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬氨酸的專利菌株（大腸埃希氏菌株 HY-05C，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 5450)和技術(shù)（專利號(hào)：201110382584.X)，本發(fā)明在原有技 術(shù)的基礎(chǔ)上，提供一種提高大腸埃希氏菌株HY-05C的高密度（高細(xì)胞濃度）的培養(yǎng)方法， 提高單位體積培養(yǎng)液中產(chǎn)酶菌體細(xì)胞的濃度（數(shù)量），進(jìn)而提高單位體積培養(yǎng)液中的L-天 冬氨酸酶活力。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種高密度培養(yǎng)大腸埃希氏菌株HY-05C的培養(yǎng)基和培養(yǎng) 方法，通過提高單位體積培養(yǎng)液中菌體細(xì)胞濃度來提高培養(yǎng)液天冬氨酸酶酶活量，從而提 高單位體積細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)天冬氨酸轉(zhuǎn)化效率。
[0006] 所述的大腸埃希氏菌株HY-05C來自煙臺(tái)恒源生物股份有限公司前期選育的L-天 冬氨酸游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)菌（記載在申請(qǐng)?zhí)枮镃N201110382584.X，申請(qǐng)日為：2011年 11月25日，發(fā)明名稱為："高產(chǎn)L-天冬氨酸酶的大腸埃希氏菌株及其應(yīng)用"。大腸埃希氏 菌株HY-05C保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5450,保藏日期為2011年11月8日。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種大腸埃希氏菌株HY-05C的高密度培養(yǎng)方法，將大腸埃希氏菌株HY-05C進(jìn)行 液體培養(yǎng)，包括如下步驟：
[0009] 1)菌株HY-05C斜面菌種活化：將冷凍保存的大腸埃希氏菌株HY-05C接種到裝有 活化培養(yǎng)基試管斜面中，35-37°C培養(yǎng)24-36小時(shí)，挑取培養(yǎng)好的斜面菌苔接入另一支活化 用試管斜面中，35-37°C培養(yǎng)24-36小時(shí)，再轉(zhuǎn)接另一斜面，35-37°C培養(yǎng)24-36小時(shí)即得活 化斜面菌種。
[0010] 2)制備菌株HY-05C-級(jí)種子液：取步驟1)得到的大腸埃希氏菌株HY-05C活化 斜面菌種，接種到裝有高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，200rpm、35?37°C、搖床培 養(yǎng)6-8小時(shí)，得到一級(jí)種子液。
[0011] 3)制備菌株HY-05C二級(jí)種子液：取步驟2)得到的一級(jí)種子液以體積比1-2%。接 種量轉(zhuǎn)接到裝有高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，控制通風(fēng)比〇. 3-0. 6vvm，相對(duì) 溶解氧濃度20-40%，攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)溶解氧需求適當(dāng)調(diào)節(jié)，罐壓0. 05-0. 08MPa，35?37°C培 養(yǎng)7-9小時(shí)，得到大腸埃希氏菌株HY-05C二級(jí)種子液。
[0012] 4)制備菌株HY-05C轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)液：將步驟3)培養(yǎng)好的大腸埃希氏菌株HY-05C 二級(jí)種子液以體積比5-10%接種量轉(zhuǎn)接到高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，控制通 風(fēng)比0. 15-0. 25vvm，相對(duì)溶解氧濃度20-40%，攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)溶解氧需求適當(dāng)調(diào)節(jié)，罐壓 0. 05-0.08MPa，35?37°C培養(yǎng)8-10小時(shí)，制得大腸埃希氏菌株HY-05C轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)液。
[0013] 上述的活化斜面培養(yǎng)基所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括（g/L):富馬酸銨10 ;牛肉膏10 ; 蛋白胨7 ;氯化鈉5 ;磷酸二氫鉀1 ;硫酸鎂0. 2,瓊脂15?20,pH7. 0?7. 2。
[0014] 上述的高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括（g/L):富馬酸銨7?12;玉米 干粉6?8 ;酵母粉1?4 ;蛋白胨6?8 ;氯化鈉5 ;磷酸二氫鉀1 ;硫酸鎂0. 2,pH6. 0? 7. 5。
[0015] 更優(yōu)選地：富馬酸銨10 ;玉米干粉8 ;酵母粉2 ;蛋白胨7 ;氯化鈉5 ;磷酸二氫鉀1 ; 硫酸鎂 〇? 2,pH6. 0。
[0016] 上述高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基是通過單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化得到的，考察指標(biāo)為單 位體積培養(yǎng)液中的菌體量和天冬氨酸酶活力，優(yōu)化過程見實(shí)施例4。
[0017] 上述菌株HY-05C高密度培養(yǎng)的工藝控制參數(shù)（接種量、培養(yǎng)時(shí)間、通風(fēng)量、相對(duì)溶 解氧濃度）是通過培養(yǎng)試驗(yàn)優(yōu)化確定的，考察指標(biāo)為最終用于轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)液中單位體積的 菌體量和天冬氨酸酶活力。具體優(yōu)化過程見實(shí)施例4。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 1.本發(fā)明通過對(duì)大腸埃希氏菌株HY-05C培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，顯著提高了 大腸埃希氏菌株HY-05C轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)液中的菌體濃度和天冬氨酸酶酶活力，進(jìn)而提高后續(xù) 轉(zhuǎn)化效率和設(shè)備利用率。
[0020] 2.與原工藝相比，本發(fā)明大腸埃希氏菌株HY-05C高密度培養(yǎng)工藝，通過對(duì)培養(yǎng)基 和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，單位體積培養(yǎng)液中菌體量較之前提高了 40% -50%、天冬氨酸酶活力 提高了 70-80%，效果顯著。
[0021] 3.與原工藝相比，本發(fā)明大腸埃希氏菌株HY-05C高密度培養(yǎng)工藝，采用三級(jí)培 養(yǎng)，增加二級(jí)種子液，采用10%大接種量接入最終培養(yǎng)大罐，不僅縮短了大罐培養(yǎng)時(shí)間，同 時(shí)使得獲得的培養(yǎng)液中的菌體生長(zhǎng)更加整齊，相對(duì)酶活力明顯增加，轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明，相同體 積的轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化效率明顯提高。
【附圖說明】
[0022] 圖1菌株HY-05C培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)效應(yīng)曲線圖
[0023] 圖2菌株HY-05C-級(jí)種子液菌體濃度和天冬氨酸酶活變化曲線
[0024] 圖3菌株HY-05C二級(jí)種子液菌體濃度和天冬氨酸酶活變化曲線
[0025] 圖4菌株HY-05C轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)液菌體濃度和天冬氨酸酶活變化曲線
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0027] 本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的菌種：大腸埃希氏菌株HY-05C，保藏在中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 5450,保藏日期為2011年11月8 曰。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 一種大腸埃希氏菌株HY-05C的高密度培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0030] 1、菌種活化
[0031] 將冷凍保存的大腸埃希氏菌株HY-05C接種到裝有活化培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方（g/ L):富馬酸銨1〇;牛肉膏1〇;蛋白胨7;氯化鈉5;磷酸二氫鉀1;硫酸鎂0. 2,瓊脂15?20， pH7. 0?7. 2)試管斜面中，35°C培養(yǎng)24小時(shí)，挑取培養(yǎng)好的斜面菌苔接入另一支活化培養(yǎng) 基試管斜面中，35°C培養(yǎng)24小時(shí)，再轉(zhuǎn)接另一斜面，35°C培養(yǎng)24小時(shí)即得活化斜面菌種。
[0032] 2、高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基配制
[0033] 按以下配方配制細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基：富馬酸10g/L，玉米干粉8g/L，酵母粉2g/L，蛋 白胨7g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0. 2g/L，將上述原料加適量水溶解，然后 用氨水調(diào)節(jié)pH至6. 0,定容，121 °C下滅菌20分鐘。
[0034] 3、一級(jí)種子液的制備
[0035] 取2支上述新鮮活化斜面菌種分別接入5L的搖瓶中，培養(yǎng)基裝液量1200ml， 200rpm，35°C，搖床培養(yǎng)8小時(shí)，培養(yǎng)液稀釋10倍，在640nm測(cè)0D值為0. 468,得到一級(jí)種子 液。
[0036] 4、二級(jí)種子液的制備
[0037] 將經(jīng)上述培養(yǎng)獲得的一級(jí)種子液（2XlOOOmL)轉(zhuǎn)接到裝有1. 5m3高密度培養(yǎng)培養(yǎng) 基的2m3培養(yǎng)罐中，調(diào)整罐壓0. 06MPa，通風(fēng)比0. 25vvm，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速維持培養(yǎng)過程中 相對(duì)溶解氧20%，35°C培養(yǎng)8小時(shí)，取培養(yǎng)液稀釋10倍，在640nm測(cè)0D值為0. 498,得到二 級(jí)種子液。
[0038] 5、轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)液制