水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于哺乳動物繁殖領(lǐng)域，尤其涉及一種水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激 活方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水牛是聯(lián)合國糧農(nóng)組織認為最具開發(fā)潛力和開發(fā)價值的家畜之一。通過玻璃化冷 凍的方法將其具有遺傳價值的卵子進行保存，可提高水牛卵子的使用價值。目前，水牛卵 母細胞的玻璃化冷凍進程仍十分緩慢，很多研宄者把玻璃化冷凍的優(yōu)化都集中在冷凍程序 上，而忽略了激活條件是否也存在問題。玻璃化冷凍除了凍融后超微結(jié)構(gòu)的改變等因素外， 激活條件也是一個重要的因素。
[0003] 卵母細胞激活是家畜顯微受精和細胞核移植的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，經(jīng)孤雌生殖而產(chǎn)生 的單倍體和純合雙倍體細胞系在各種遺傳學中都具有重要的價值，可用于間接評估研宄胚 胎發(fā)育初始機制。隨著這些研宄的不斷深入，利用孤雌激活得到的囊胚內(nèi)細胞團建立胚胎 干細胞系，挖掘優(yōu)良的遺傳資源，有助于闡明孤雌生殖與有性生殖的內(nèi)在聯(lián)系與差異。孤雌 生殖技術(shù)也是衡量體外培養(yǎng)卵母細胞成熟的方法，尤其對評價動物卵母細胞玻璃化冷凍后 發(fā)育潛能的高低至關(guān)重要。Lan(文獻1)和Nasr-Esfahani(文獻2)通過系統(tǒng)地分析不同 的激活條件，表明離子霉素處理時間與濃度明顯影響到卵母細胞的發(fā)育能力。同樣，2010 年，Nasr-Esfahani(文獻3)也發(fā)現(xiàn)6-DMAP的處理會影響到紡錘體軸的旋轉(zhuǎn)、原核的形成 和胚胎的發(fā)育。離子霉素是通過引發(fā)Ca2+內(nèi)流或鈣庫釋放而達到卵母細胞的激活；6-DMAP 則主要抑制成熟促進因子（MaturationorM-PhasePromotingFactor,MPF)和/或細胞 靜止因子（CytostatieFactor，CSF)的活性和第二極體的排出，形成二倍體胚胎。2012年， Asgari(文獻4)研宄發(fā)現(xiàn)綿羊成熟卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍后，細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化， 而這些變化在一定程度上具有輕微激活卵母細胞的特征，相比于新鮮卵母細胞的激活，其 激活閾值相對較低。
[0004] 目前，幾乎所有冷凍復(fù)蘇后的卵母細胞在進行這些操作時普遍采用與新鮮卵母細 胞一樣的激活程序。事實上，復(fù)蘇的卵母細胞與新鮮的卵母細胞相比，在某些方面可能沒有 處于同樣的水平，導(dǎo)致其孤雌激活條件與新鮮的卵母細胞有所不同，若采用與新鮮卵母細 胞同等的激活條件，將降低凍融后卵母細胞的激活率，同時也會降低卵母細胞的后續(xù)發(fā)育 能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種專門針對冷凍復(fù)蘇后的卵母細胞可提高其 激活率的水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，進而提高凍融后卵母細胞的存活率和 發(fā)育潛能。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：水牛卵母細胞玻璃化冷凍后 孤雌激活方法，先將凍融恢復(fù)后的卵母細胞置于3. 5ymol/L的離子霉素工作液激活處理 5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培養(yǎng)2-4h。
[0007] 上述水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，先將凍融恢復(fù)后的卵母細胞置于 3. 5ymol/L的離子霉素工作液激活處理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培養(yǎng) 4h，然后經(jīng)培養(yǎng)液洗滌3次移入顆粒細胞單層微滴于39°C，5% 0)2和最大飽和濕度的培養(yǎng) 箱中共培養(yǎng)。
[0008] 共培養(yǎng)過程中，每隔2天半量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后檢查分裂率，7-8天記錄囊胚 發(fā)育率。
[0009] 目前水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活歷經(jīng)三步驟：卵母細胞的采集與成熟； 對卵母細胞進行冷凍_解凍；將凍融后的卵母細胞進行激活。傳統(tǒng)方法進行孤雌激活時，沒 有考慮到復(fù)蘇的卵母細胞與新鮮的卵母細胞可能存在一定水平的不同，未對激活條件進行 針對性研宄，而往往直接采用與新鮮卵母細胞同等的激活條件，因而降低了凍融后卵母細 胞的激活率，同時也會降低卵母細胞的后續(xù)發(fā)育能力。為此，發(fā)明人對現(xiàn)有技術(shù)進行了深入 研宄，深度優(yōu)化了水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，從而建立了本發(fā)明的方法。該 法采用優(yōu)化的離子霉素（ionomycin)聯(lián)合6-DMAP(6-二甲基氨基嘌呤）的激活處理方式， 改良了已有水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法。實驗證明，孤雌激活條件對冷凍復(fù) 蘇水牛卵母細胞的發(fā)育潛能存在一定影響。應(yīng)用本發(fā)明專門針對冷凍復(fù)蘇后的卵母細胞的 孤雌激活方法，可提高其激活率，進而提高凍融后卵母細胞的存活率和發(fā)育潛能。
【附圖說明】
[0010] 圖1是研宄和應(yīng)用本發(fā)明水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0011] 一、試驗材料
[0012] 水牛卵巢由南寧屠宰場提供。試驗所用的試劑除TCM-199購自Gibco公司外，其 他試劑如無特殊說明均購自Sigma化學公司。主要儀器設(shè)備有體視顯微鏡、0)2培養(yǎng)箱、4°C 冰箱、液氮罐。
[0013] 二、試驗方法
[0014] (1)卵母細胞的收集與體外成熟
[0015] 卵母細胞的收集與體外成熟的操作方法參考Zhuang(文獻5)。從屠宰場獲得卵 巢后，剪去周邊多余的組織，再用注射器抽取卵巢表面直徑為2-6_卵泡中的卵母細胞，在 39°C，5%C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行體外成熟培養(yǎng)22-24h。成熟培養(yǎng)后，挑選排 出第一極體、胞質(zhì)均勻、飽滿的成熟卵母細胞，進行后續(xù)實驗。
[0016] (2)卵母細胞的冷凍
[0017] 將步驟（1)成熟培養(yǎng)后的細胞，挑選排出第一極體、胞質(zhì)均勻、飽滿的成熟卵母 細胞進行冷凍。玻璃化冷凍水牛卵母細胞的操作方法參考（文獻6)。冷凍時將室溫調(diào)至 22-24°C。首先將成熟卵母細胞先移入含有20 %FBS的冷凍基礎(chǔ)液（TCM199-Ifepes緩沖液） 中5!^11，隨后移入冷凍平衡液〇111199-11印68+20%?85+10%二甲基亞砜+10%乙二醇）中 lmin，觀察卵母細胞大體滲透充分后，移入冷凍液（TCM199-Ifepes+20%FBS+20%二甲基亞 砜+20%乙二醇+0.5M蔗糖）中，30s內(nèi)轉(zhuǎn)移到冷凍管內(nèi)，迅速投入液氮。每次操作卵母細 胞數(shù)為5個，所帶液體體積〈1yL。
[0018] (3)卵母細胞的解凍
[0019] 步驟⑵的卵母細胞在液氮保存l-2d，隨即解凍。將解凍液（TCM199-Ifepes+20% FBS+0. 5M蔗糖）提前2h于培養(yǎng)箱預(yù)熱。解凍過程均在37°C的加熱板上進行，將冷凍管從 液氮中取出，將含有卵母細胞端的冷凍管迅速浸入解凍液中使卵母細胞排到解凍液。在解 凍液平衡5min，將其移入含有20%FBS的冷凍基礎(chǔ)液中5min，最后移入含有20%FBS的冷 凍基礎(chǔ)液，在39°C，5%C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1-1.5h后進行后續(xù)實驗。
[0020] (4)孤雌激活
[0021] 將步驟（3)凍融恢復(fù)后的卵母細胞按實驗設(shè)計方案置于離子霉素工作液激活處 理，再移入含6-DMAP的工作液培養(yǎng)，最后經(jīng)培養(yǎng)液洗滌3次移入顆粒細胞單層微滴于39°C， 5%C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，對照組直接進行常規(guī)激活（即5ymol/L離子 霉素激活5min，結(jié)合2mmol/L6-DMAP處理4h)。每隔2天半量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后檢 查分裂率，7-8天記錄囊胚發(fā)育率。
[0022] (5)實驗設(shè)計
[0023] 試驗1離子霉素作用濃度對水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影響
[0024] 將凍融恢復(fù)后的卵母細胞隨機分為4組進行以下處理：
[0025] I組：5 u mol/L 5min ionomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0026] II組：3. 5 umol/L 5min ionomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0027] III組：2 umol/L 5min ionomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0028] IV組：1 y mol/L 5min i onomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0029] 對照組為新鮮的成熟卵母細胞。
[0030] 最后移入制備好的顆粒細胞單層共培養(yǎng)，觀察后續(xù)發(fā)育能力。
[0031] 試驗26-DMAP濃度和處理時間對水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影 響
[0032] 從試驗1中選取離子霉素的最佳處理濃度進行試驗2。將凍融恢復(fù)后的卵母細胞 隨機分為4組進行以下處理：
[0033]I組：ionomycin處理+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP；
[0034]II組：ionomycin處理+2mmo1 /T, 2h 6-DMAP ;
[0035]III組：ionomycin處理+1mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0036]IV組：ionomycin處理+1mmo1 /T, 2h 6-DMAP ;
[0037] 對照組為新鮮的成熟卵母細胞。
[0038] 激活后移入制備好的顆粒細胞單層共培養(yǎng)，觀察后續(xù)發(fā)育能力。
[0039] 三、試驗結(jié)果
[0040]1.離子霉素作用濃度對水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影響[0041] 水牛成熟卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍并解凍復(fù)蘇，使用不同濃度的離子霉素進行孤雌 激活，如表1所示，其卵裂率、4-細胞率、8細胞率和囊胚率比對照組均有所下降（P〈0. 01)。 在四個處理組中，當離子霉素濃度為3. 5ymol/L時，其卵裂率（57. 0±1. 1) %、8細胞率 (31. 1 ±2. 1) %和囊胚率（11. 2±0. 9) %均顯著高于其它處理組（除I組的4-細胞率外）
[0042] (P〈0. 05)。結(jié)果表明，水牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍-解凍復(fù)蘇后，使用 3. 5ymol/L的離子霉素激活5min，可提高卵母細胞凍融后孤雌激活率。
[0043] 表1不同濃度的離子霉素對水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影響
[0044]
【主權(quán)項】
1. 一種水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，其特征在于：先將凍融恢復(fù)后的卵 母細胞置于3. 5 ymol/L的離子霉素工作液激活處理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的 工作液培養(yǎng)2-4h。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，其特征在于： 先將凍融恢復(fù)后的卵母細胞置于3. 5 ymol/L的離子霉素工作液激活處理5min，再移入 2mmol/L的含6-DMAP的工作液培養(yǎng)4h，然后經(jīng)培養(yǎng)液洗滌3次移入顆粒細胞單層微滴于 39°C，5% C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，其特征在于共培 養(yǎng)過程中，每隔2天半量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后檢查分裂率，7-8天記錄囊胚發(fā)育率。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，該法采用優(yōu)化的離子霉素聯(lián)合6-DMAP的激活處理方式，改良優(yōu)化了已有水牛卵母細胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法。實驗證明，孤雌激活條件對冷凍復(fù)蘇水牛卵母細胞的發(fā)育潛能存在一定影響。應(yīng)用本發(fā)明專門針對冷凍復(fù)蘇后的卵母細胞的孤雌激活方法，可提高其激活率，進而提高凍融后卵母細胞的存活率和發(fā)育潛能。
【IPC分類】C12N5-075
【公開號】CN104593322
【申請?zhí)枴緾N201510013826
【發(fā)明人】盧克煥, 王彩玲, 張華智, 陸陽清, 楊小淦, 許惠艷
【申請人】廣西大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月12日